破骨細胞におけるDAP12を介したITAMシグナル経路を制御する分子機構の解明

阐明控制破骨细胞中 DAP12 介导的 ITAM 信号通路的分子机制

• 批准号: 21K09299
• 负责人: 北川 教弘
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K09299/
• 关键词: 骨代謝; 破骨細胞; シグナル伝達; 免疫学; 糖鎖

本研究は破骨細胞分化に重要なSiglec-15-DAP12複合体を介したシグナル系と転写因子NFATc1の関連を分子レベルで解明し、１）骨吸収活性を有する破骨細胞が形成される分子機序の理解、および２）Siglec-15を標的とする治療法開発への応用に貢献することを目的としている。当該年度は下記2項目の成果を得た。１）破骨細胞における（Siglec-15に結合するDAP12）/（全DAP12量）の算出を試みた。RAW264細胞からin vitroで分化誘導した破骨細胞から細胞抽出液を作成し、抗Siglec-15抗体でimmunodepletionを行った。免疫沈降前後の上精を抗Siglec-15抗体でウェスタンブロットした結果、Siglec-15量は免疫沈降前と比較して16%まで減少していたのに対し、DAP12は86%に減少が止まった。同時に対照抗体ではSiglec-15、DAP12ともに免疫沈降前後でほぼ変わらなかった。このことは破骨細胞で発現するDAP12の大部分がSiglec-15と会合していないことを示唆する。２）多発性骨嚢胞と白質脳症による認知症を呈する那須・ハコラ病は劣性遺伝疾患であり、DAP12はその原因遺伝子の一つとして見出されている。またDAP12 遺伝子欠損マウスは視床領域でオリゴデンドロサイトの成熟に障害を原因とする髄鞘形成不全を呈することが報告されている。そこで13週齢Siglec-15遺伝子欠損マウスの視床領域切片を作成し、抗ミエリン結合タンパク質抗体にて免疫染色した。その結果Siglec-15遺伝子欠損マウスの染色像は野生型と差が認められなかった。

这项研究旨在阐明由SIGLEC-15-DAP12复合物介导的信号系统与转录因子NFATC1介导的信号系统，这对于分子水平上的破骨细胞分化很重要，并有助于1）对分子机制的理解，在该分子机制中对骨骼的骨化活性形成了5），并形成了2）。在财政年度获得以下两个项目的结果。 1）我们尝试计算破骨细胞中的（DAP12结合与Siglec-15）/（总DAP12量）。细胞提取物是从已在体外分化与RAW264细胞的破骨细胞中制备的，并用抗Siglec-15抗体进行了免疫序列。与免疫沉淀之前相比，用抗SigLec-15抗体免疫沉淀之前和之后，上清液的蛋白质印迹显示Siglec-15的量降至16％，而DAP12的量降至86％。同时，在对照抗体中免疫沉淀之前和之后，SIGLEC-15和DAP12都没有改变。这表明在破骨细胞中表达的大多数DAP12与SIGLEC-15无关。 2）由多个骨囊肿和白血病引起的痴呆症的NASU-Hakora病是一种隐性遗传疾病，并且发现DAP12是病因基因之一。还据报道，缺乏DAP12基因的小鼠由于丘脑区域的少突胶质细胞成熟而患有肿瘤。因此，制备了13周龄Siglec-15基因缺陷小鼠的丘脑区域切片，并用抗膜蛋白结合蛋白抗体进行免疫染色。结果，从野生型中观察到缺乏SIGLEC-15基因的小鼠的染色图像差异。