病原性細菌の新規遺伝子型別法の提唱

細菌感染による食中毒や感染症等の発生時には、「起因菌の同定」と共に「菌株の型別」を実施する必要がある。本研究は、微生物の染色体DNA上に存在するポリプリン-ポリピリミジン（PolyR）配列情報を利用した遺伝子型別方法論の確立と簡便で迅速な検査法への応用を目的としている。令和４年度は以下の実験を実施した。迅速かつ簡便なPolyR配列の検出を目的に、対象とするPolyR配列の三重鎖DNA形成をトリガーとしたローリングサークル増幅(RCA)反応の検討をした。本反応は4つの段階から成り、1) 対象とするPolyR配列に対して選択的に三重鎖DNAを形成するモレキュラービーコン(MB)を用いて、三重鎖DNAを形成する段階と2) 三重鎖DNA構造の形成によりヘアピン構造が開いたMBの3’末端側と環状一本鎖DNA（増幅産物にG4構造を形成するようにデザインした）の配列特異的なアニーリングの段階、3) MBとアニーリングした環状一本鎖DNAのRCA反応によるG4構造の増幅段階、そして4)RCA反応によって生じたG4構造をチオフラビンTの存在下で蛍光検出する段階からなる。まず初めに、4段階の反応をone-pot反応で実施した。しかしながら、三重鎖DNAの形成条件では、RCA反応に利用するポリメラーゼ活性の著しい低下が確認された。そこで、4段階の反応を段階的に実施することでこの問題点を検討した。結果として、1)、2)の段階を三重鎖DNA形成条件で反応後、4倍希釈した反応液を3)のRCA反応に使用することで、生成したG4構造とチオフラビンTとの結合による蛍光を確認した。しかし、1)、2)の段階の反応液を希釈してRCA反応に供するため、増幅時間を長くして感度を上げる必要があり、そのことがバックグラウンドの増加によるS/N比の低下につながった。

細菌感染による食中毒や感染症等の発生時には、「起因菌の同定」と共に「菌株の型別」を実施する必要がある。本研究は、微生物の染色体DNA上に存在するポリプリン-ポリピリミジン（PolyR）配列情報を利用した遺伝子型別方法論の確立と簡便で迅速な検査法への応用を目的としている。令和４年度は以下の実験を実施した。迅速かつ簡便なPolyR配列の検出を目的に、対象とするPolyR配列の三重鎖DNA形成をトリガーとしたローリングサークル増幅(RCA)反応の検討をした。本反応は4つの段階から成り、1) 対象とするPolyR配列に対して選択的に三重鎖DNAを形成するモレキュラービーコン(MB)を用いて、三重鎖DNAを形成する段階と2) 三重鎖DNA構造の形成によりヘアピン構造が開いたMBの3’末端側と環状一本鎖DNA（増幅産物にG4構造を形成するようにデザインした）の配列特異的なアニーリングの段階、3) MBとアニーリングした環状一本鎖DNAのRCA反応によるG4構造の増幅段階、そして4)RCA反応によって生じたG4構造をチオフラビンTの存在下で蛍光検出する段階からなる。まず初めに、4段階の反応をone-pot反応で実施した。しかしながら、三重鎖DNAの形成条件では、RCA反応に利用するポリメラーゼ活性の著しい低下が確認された。そこで、4段階の反応を段階的に実施することでこの問題点を検討した。結果として、1)、2)の段階を三重鎖DNA形成条件で反応後、4倍希釈した反応液を3)のRCA反応に使用することで、生成したG4構造とチオフラビンTとの結合による蛍光を確認した。しかし、1)、2)の段階の反応液を希釈してRCA反応に供するため、増幅時間を長くして感度を上げる必要があり、そのことがバックグラウンドの増加によるS/N比の低下につながった。