病原性細菌の新規遺伝子型別法の提唱

提出一种新的病原菌基因分型方法

• 批准号: 20K18923
• 负责人: 安川 和志
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Toyama Institute of Health
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K18923/
• 关键词: 遺伝子型別; 三重鎖DNA; レジオネラ属菌; 病原性細菌; ポリプリン配列; 微生物

細菌感染による食中毒や感染症等の発生時には、「起因菌の同定」と共に「菌株の型別」を実施する必要がある。本研究は、微生物の染色体DNA上に存在するポリプリン-ポリピリミジン（PolyR）配列情報を利用した遺伝子型別方法論の確立と簡便で迅速な検査法への応用を目的としている。令和４年度は以下の実験を実施した。迅速かつ簡便なPolyR配列の検出を目的に、対象とするPolyR配列の三重鎖DNA形成をトリガーとしたローリングサークル増幅(RCA)反応の検討をした。本反応は4つの段階から成り、1) 対象とするPolyR配列に対して選択的に三重鎖DNAを形成するモレキュラービーコン(MB)を用いて、三重鎖DNAを形成する段階と2) 三重鎖DNA構造の形成によりヘアピン構造が開いたMBの3’末端側と環状一本鎖DNA（増幅産物にG4構造を形成するようにデザインした）の配列特異的なアニーリングの段階、3) MBとアニーリングした環状一本鎖DNAのRCA反応によるG4構造の増幅段階、そして4)RCA反応によって生じたG4構造をチオフラビンTの存在下で蛍光検出する段階からなる。まず初めに、4段階の反応をone-pot反応で実施した。しかしながら、三重鎖DNAの形成条件では、RCA反応に利用するポリメラーゼ活性の著しい低下が確認された。そこで、4段階の反応を段階的に実施することでこの問題点を検討した。結果として、1)、2)の段階を三重鎖DNA形成条件で反応後、4倍希釈した反応液を3)のRCA反応に使用することで、生成したG4構造とチオフラビンTとの結合による蛍光を確認した。しかし、1)、2)の段階の反応液を希釈してRCA反応に供するため、増幅時間を長くして感度を上げる必要があり、そのことがバックグラウンドの増加によるS/N比の低下につながった。

When pathogenic bacteria, food poisoning, infection, etc. occur, the identification of the causative bacteria and the type of the strain must be carried out. The purpose of this study is to establish a simple and rapid method for detecting the presence of polyprotein (PolyR) on chromosomal DNA of microorganisms by using the polyprotein alignment information. The order and the following four years have been implemented. Rapid and easy detection of PolyR alignment for the purpose of, for example, triple-lock DNA formation of PolyR alignment 1) PolyR alignment, 3 'end of MB, 3' end of MB, 4 'end of MB, 3' end of MB, 4 'end of MB, 3' end of MB, 3 'end of (3) MB and MB are missing from the RCA sequence of the ring-like DNA lock.(4)RCA sequence is missing from the G4 sequence.(5) G4 sequence is missing from the RCA sequence.(6) G4 sequence is missing from the RCA sequence. The first and fourth stages of the reverse are one-pot reverse. The conditions for the formation of triple-locked DNA were confirmed by the low activity of RCA reverse transcription. This paper discusses the problem of the implementation of the four stages of the reverse phase. The results showed that the formation conditions of triple-locked DNA in the first and second stages were reversed, and the reaction conditions in the third stage were reversed. For example, if the reaction liquid of the step 1) and 2) is required to increase the S/N ratio, the increase of the amplitude time and the increase of the sensitivity are necessary.

项目成果

三本鎖DNA形成条件の予測と応用研究

三链DNA形成条件预测及应用研究

• 发表时间: 2022
• 作者: 安川和志;金谷潤一;綿引正則
• 通讯作者: 綿引正則

ポリプリン-ポリピリミジン配列情報をベースとした新規遺伝子型別法

基于多嘌呤-多嘧啶序列信息的新型基因分型方法

• 发表时间: 2021
• 作者: Morishima Toshitaka;Sato Akira;Nakata Kayo;Matsumoto Yoshifumi;Koeda Nobuyuki;Shimada Hiroko;Maruhama Tsutomu;Matsuki Daisaku;Miyashiro Isao;安川和志
• 通讯作者: 安川和志