Research of Genetic Code Restoration Therapy-Restoration of Mutated RNAs by Artificial RNA Editing

遗传密码修复疗法研究——人工RNA编辑修复突变RNA

基本信息

批准号：
21H02067
负责人：
塚原俊文
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、遺伝子の点変異を原因とする疾患に対する治療法として、発現している変異したRNAの変異を人工酵素複合体の導入によってCの脱アミノ化あるいはUへのアミノ基転移による塩基置換によって変異を修復し、疾患を治療する方法の確立を目的としている。劣性遺伝形式の疾患で対立遺伝子の片方が正常であれば疾患は発症しないことから、RNAの修復効率50%以上の実現を目指して研究を行っている。令和3年度はまず、植物由来のRNA編集システムの利用を検討した。植物ではPPRタンパク質のC末端に存在するDYWドメインがCの脱アミノ化を触媒することが判明している。我々はU⇒C RNA編集が顕著に観察されるツノゴケのPPRタンパク質遺伝子からDYWドメインとDYWに相同性を有する2つのドメイン（GRPおよびDRH）遺伝子断片を単離し、PPR56とその標的遺伝子nad4を利用した大腸菌アッセイ系でRNA編集活性を調べた。残念ながらU⇒C置換活性は確認出来ていないが、ツノゴケ由来のDYWはシロイヌナズナ由来に比べC⇒U変換活性が高いことが明らかとなった。そこで、これまでにADAR1やAPOBEC1を用いて人工RNA編集酵素複合体の創成に成功したMS2システムを介してguide RNAと結合させた。この植物由来の人工RNA編集酵素複合体遺伝子をHEK293細胞に導入したところ、非常に効率良いC⇒U変換が認められ、ほとんどの変異RNAが修復されることが判明した。さらに従来のguide RNAを改良し、標的RNAに相補的な配列の両側に1つのMS2 loop RNAを付加することによってAPOBEC1を利用した人工RNA編集酵素でもC⇒U RNA編集効率を50%以上に向上させることに成功した。これらの結果によって、人為的なRNA編集による点変異RNAの修復疾患治療法は実用化レベルに達したと考えている。

这项研究旨在建立一种通过在基因中通过引入人工酶复合物或通过Transamino群体脱氨酸或脱氨基替换为U并治疗疾病的方法来治疗基因中点突变引起的疾病的方法。在隐性遗传疾病中，如果等位基因之一正常，则该疾病将不会发展，因此我们正在进行研究，目的是达到50％或以上的RNA修复效率。在2021财政年度，我们首先考虑使用植物来源的RNA编辑系统。在植物中，已经发现位于PPR蛋白C末端的DYW结构域可催化C的脱氨酸。基因NAD4。不幸的是，尚未证实U-> C的替代活性，但据透露，源自角苔藓的Dyw具有比拟南芥更高的C-> U转化活性。因此，进行结合是为了通过MS2系统引导RNA，该系统成功地创建了使用ADAR1和APOBEC1的人工RNA编辑酶复合物。当将这种植物衍生的人工RNA编辑酶复合基因引入HEK293细胞时，发现观察到非常有效的C-> U转化率，并修复了大多数突变的RNA。此外，通过改善传统的指南RNA，我们通过将一个MS2环RNA添加到与目标RNA互补的序列的两侧，将C区RNA编辑效率提高到50％以上。这些结果表明，人工RNA编辑导致了点突变RNA修复的实际处理水平。