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Research of Genetic Code Restoration Therapy-Restoration of Mutated RNAs by Artificial RNA Editing

遗传密码修复疗法研究——人工RNA编辑修复突变RNA

基本信息

批准号：
21H02067
负责人：
塚原俊文
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、遺伝子の点変異を原因とする疾患に対する治療法として、発現している変異したRNAの変異を人工酵素複合体の導入によってCの脱アミノ化あるいはUへのアミノ基転移による塩基置換によって変異を修復し、疾患を治療する方法の確立を目的としている。劣性遺伝形式の疾患で対立遺伝子の片方が正常であれば疾患は発症しないことから、RNAの修復効率50%以上の実現を目指して研究を行っている。令和3年度はまず、植物由来のRNA編集システムの利用を検討した。植物ではPPRタンパク質のC末端に存在するDYWドメインがCの脱アミノ化を触媒することが判明している。我々はU⇒C RNA編集が顕著に観察されるツノゴケのPPRタンパク質遺伝子からDYWドメインとDYWに相同性を有する2つのドメイン（GRPおよびDRH）遺伝子断片を単離し、PPR56とその標的遺伝子nad4を利用した大腸菌アッセイ系でRNA編集活性を調べた。残念ながらU⇒C置換活性は確認出来ていないが、ツノゴケ由来のDYWはシロイヌナズナ由来に比べC⇒U変換活性が高いことが明らかとなった。そこで、これまでにADAR1やAPOBEC1を用いて人工RNA編集酵素複合体の創成に成功したMS2システムを介してguide RNAと結合させた。この植物由来の人工RNA編集酵素複合体遺伝子をHEK293細胞に導入したところ、非常に効率良いC⇒U変換が認められ、ほとんどの変異RNAが修復されることが判明した。さらに従来のguide RNAを改良し、標的RNAに相補的な配列の両側に1つのMS2 loop RNAを付加することによってAPOBEC1を利用した人工RNA編集酵素でもC⇒U RNA編集効率を50%以上に向上させることに成功した。これらの結果によって、人為的なRNA編集による点変異RNAの修復疾患治療法は実用化レベルに達したと考えている。

The aim of this study is to establish a method for the treatment of the causes and diseases of gene mutation and RNA mutation, and to establish a method for the treatment of diseases by gene mutation and RNA mutation and the introduction of artificial enzyme complexes. The study was conducted to investigate the occurrence of a disease with a 50% or higher RNA repair efficiency. In 2002 and 2003, the use of RNA from plants was investigated. The presence of PPR at the C-terminal of the plant is identified as a catalyst for the removal of PPR from the plant We have investigated the use of PPR gene fragments from DYW to DYW, and we have identified two different gene fragments (GRP and DRH) from GRP to DRH, and we have used PPR gene 56 to modulate RNA editing activity in E. coli. The activity of U <$C substitution is confirmed to be higher than that of C <$C substitution ADAR1 and APOBEC1 were successfully synthesized by using an artificial RNA assembly enzyme complex. This plant-derived artificial RNA editing enzyme complex was introduced into HEK293 cells and the abnormal efficiency was identified. In addition, APOBEC1 was successfully used to improve the efficiency of RNA editing by more than 50%. The results of this research are as follows: artificial RNA compilation, RNA repair and disease treatment