神経特異的スプライシング因子、NSSRの機能解析と遺伝子破壊マウスの表現型解析

神经元特异性剪接因子、NSSR 的功能分析以及基因破坏小鼠的表型分析

基本信息

批准号：
13035061
负责人：
塚原俊文
金额：
$ 3.84万
依托单位：
National Center of Neurology and Psychiatry
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

神経で発現する遺伝子の多くが選択的スプライシングによってその機能が調節される。神経でのスプライシング制御機構を明らかにするため、マウス脳より神経特異的に発現するスプライシング因子を検索し、新規SRタンパク質、NSSR1および2を単離した。これら二種のタンパク質は同一ゲノムから選択的スプライシングによって生成されるが、NSSR1はGluR2遺伝子exon 14のskippingに抑制的に、一方、NSSR2は促進的に働く事が明らかとなった。NSSRタンパク質の機能をより詳細に解析するため、酵母two-hybrid系によるscreeningを行った。NSSR2にはTra2βあるいはSRP30cが結合した。COS細胞を用いたpull-down assayでも共沈する事が示された。また、spliceosomeの構成因子であるU1-70Kタンパク質とも結合する事が明らかとなった。従って、NSSRタンパク質はこれらタンパク質と供にspliceosomeを構成し、機能していると推定された。スプライシング因子はこれまで互いにSR部位で結合していると考えられてきた。しかし、NSSR2ではSR部位がtruncateされて不完全であるため、他の部位が互いの結合に関与している事が示唆された。RNA結合部位を他のRNA結合配列に交換しても、NSSR1は神経特異的スプライシングを促進し、逆にNSSR2は抑制する事も明らかとなり、スプライシングの制御はSR部位を含むC末端側によって行われていると推定された。NSSRは網膜や嗅組織での発現が多く認められることから、感覚神経におけるスプライシングへの関与が強く示唆される。さらに、生理的機能を調べる目的で遺伝子破壊マウスを作成した。Nullマウスは一見正常であり、外見上の差異は認められなかった。感覚器官を中心により詳細な行動解析が必要であり、今後の課題となった。

在神经元中表达的许多基因受替代剪接调节。为了阐明神经中剪接调节的机制，我们搜索了从小鼠大脑中表达神经异能的剪接因子，并分离了新型的SR蛋白NSSR1和2。这两种蛋白质是通过替代剪接从同一基因组产生的，并且已经揭示了NSSR1在跳过GlUR2基因14，而NSSR2主动起作用。为了进一步分析NSSR蛋白的功能，使用酵母两杂交系统进行了筛选。 NSSR2由TRA2β或SRP30C结合。还显示，还使用使用COS细胞的下拉测定法进行了共沉淀。还已经揭示了它也与U1-70K蛋白结合，这是剪接体的构成因子。因此，假定NSSR蛋白与这些蛋白质构成剪接体和功能。剪接因子以前被认为是在SR位点彼此绑定的。但是，由于SR位点在NSSR2中被截断且不完整，因此建议其他位点彼此结合。同样清楚的是，即使将RNA结合位点交换为其他RNA结合序列，NSSR1也会促进神经特异性的剪接，相反，NSSR2抑制了NSSR2，并且假定剪接是由C-末端进行的，该c-末端是包含SR位点的C-末端。由于NSSR在视网膜和嗅觉组织中高度表达，因此强烈建议它参与了感觉神经中的剪接。此外，创建了基因破坏小鼠以研究生理功能。无效小鼠显然是正常的，没有观察到外部差异。详细的行为分析是必要的，重点是感官器官，这已成为未来的挑战。