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遺伝子変異のインビボ修復による疾患治療法の開発

通过体内修复基因突变开发疾病治疗方法

基本信息

批准号：
19659084
负责人：
塚原俊文
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Japan Advanced Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、Leigh症候群患者に存在するミトコンドリアATPase6遺伝子のT→C点変異症例を対象に、患者由来細胞を用いたin vivo実験を行って遺伝子修復するための方法を確立することを目的としている。これまでに、患者細胞由来の全DNA、全RNAあるいはin vitroで調製した変異を持つ全長のATPase6-mRNAをターゲットに塩基配列特異的な光化学的脱アミノ化を試み、ヘアピン型CVU含有ODNを用いた部位特異的なCの脱アミノ化が可能であることを示した。RNAの修復効率は、in vitroで合成した全長のATPase 6-mRNAをターゲットした場合は10.8%、Leigh脳症患者由来の全RNAの場合は7.6%であった。本年度はin vivoで同様のRNA修復を確認するため、ヘアピン型CVU含有ODNを患者細胞内に導入し、RNA修復の有無を調べることを目的に実験を行った。まず、無菌状態でのUV照射法を検討するため、様々な条件で細胞培養皿を介した脱アミノ化を試みたところ、スライドグラスを介してUV照射を行った場合に、最も塩基置換の効率が高いことが示された。この結果から、以後の実験にはガラスボトムディッシュ:ホール径27mmを用いた。引き続き、Leigh脳症患者由来の初代培養線維芽細胞にヘアピンにヘアピン型CVU含有ODNを導入後、UV照射を行ってRNAの修復を試み、RFLPによって脱アミノ化を確認した。しかし、RNAの修復は全く認められなかった。GFPプラスミドを指標として確認したところ、本培養細胞は遺伝子導入効率が高いとされるLipofectamine LTXやFuGENE 6によっても遺伝子が導入されなかったことから、今回の変異修復の失敗はODNの導入効率が極めて低いことが原因であると考えられた。今後、物理的導入法も含め、効率の高い遺伝子導入法の検索が必要であると結論した。

This study aims to establish a method for the treatment of Leigh syndrome patients with T→C site mutations and patient-derived cells in vivo. Therefore, the entire DNA and entire RNA derived from the patient's cells can be modulated in vitro to allow the full-length ATPase6-mRNA to be used in a targeted manner for the photochemical degradation of specific amino acid groups. This demonstrates that it is possible to use the targeted CVU containing ODN to achieve site-specific degradation of C. RNA repair rate was 10.8% in vitro and 7.6% in Leigh syndrome. This year, the same RNA repair in vivo was confirmed, and ODN was introduced into the patient's cells. In the case of sterile and UV irradiation, the efficiency of radical substitution is high. The result is that the diameter of the tube is 27 mm. The primary culture line derived from Leigh's disease was used to confirm the presence of ODN in CVU, UV irradiation, RNA repair and RFLP. RNA repair is complete. The results showed that the rate of ODN introduction in cultured cells was higher than that in Lipofectamine LTX and FuGENE 6, and the rate of ODN introduction in cultured cells was lower than that in Lipofectamine LTX and FuGENE 6. In the future, the introduction of physical methods, including high efficiency and high efficiency, is necessary for the implementation of sub-introduction methods.

项目成果

期刊论文数量（13）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Protected DNA Probes' capable of strong hybridization without removal of base protecting groups

受保护的 DNA 探针能够进行强杂交，无需去除碱基保护基团

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
Nucleic Acids Res. 36
影响因子：
0
作者：
Ohkubo A;Kasuya R;Sakamoto K;Miyata K;Taguchi H;Nagasawa H;Tsukahara T;Watanobe T;Maki Y;Seio K;Sekine M
通讯作者：
Sekine M

'Protected DNA Probes' capable of strong hybridization without removal of base protecting groups.

“受保护的 DNA 探针”能够进行强杂交，无需去除碱基保护基团。

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
Nucleic Acids Res. 36
影响因子：
0
作者：
Ohkubo A;Kasuya R;SakamotoK;Miyata K;Taguchi H;Nagasawa H;Tsukahara T;WatanobeT;Maki Y;Seio K;Sekine M
通讯作者：
Sekine M

Change of Expression of ACTNl and Sr3A Genes During Early Stage of Neural Differentiation in P19 Cells

P19细胞神经分化早期ACTN1和Sr3A基因表达变化