遺伝子変異のインビボ修復による疾患治療法の開発

通过体内修复基因突变开发疾病治疗方法

• 批准号: 19659084
• 负责人: 塚原 俊文
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19659084/
• 关键词: 遺伝子治療; 遺伝子修復; 化学的脱アミノ化; カルボキシビニルウリジン; オリゴデオキシヌクレオチド; 光化学反応; ATPase 6; PCR-RFLP; ATPase6

本研究は、Leigh症候群患者に存在するミトコンドリアATPase6遺伝子のT→C点変異症例を対象に、患者由来細胞を用いたin vivo実験を行って遺伝子修復するための方法を確立することを目的としている。これまでに、患者細胞由来の全DNA、全RNAあるいはin vitroで調製した変異を持つ全長のATPase6-mRNAをターゲットに塩基配列特異的な光化学的脱アミノ化を試み、ヘアピン型CVU含有ODNを用いた部位特異的なCの脱アミノ化が可能であることを示した。RNAの修復効率は、in vitroで合成した全長のATPase 6-mRNAをターゲットした場合は10.8%、Leigh脳症患者由来の全RNAの場合は7.6%であった。本年度はin vivoで同様のRNA修復を確認するため、ヘアピン型CVU含有ODNを患者細胞内に導入し、RNA修復の有無を調べることを目的に実験を行った。まず、無菌状態でのUV照射法を検討するため、様々な条件で細胞培養皿を介した脱アミノ化を試みたところ、スライドグラスを介してUV照射を行った場合に、最も塩基置換の効率が高いことが示された。この結果から、以後の実験にはガラスボトムディッシュ:ホール径27mmを用いた。引き続き、Leigh脳症患者由来の初代培養線維芽細胞にヘアピンにヘアピン型CVU含有ODNを導入後、UV照射を行ってRNAの修復を試み、RFLPによって脱アミノ化を確認した。しかし、RNAの修復は全く認められなかった。GFPプラスミドを指標として確認したところ、本培養細胞は遺伝子導入効率が高いとされるLipofectamine LTXやFuGENE 6によっても遺伝子が導入されなかったことから、今回の変異修復の失敗はODNの導入効率が極めて低いことが原因であると考えられた。今後、物理的導入法も含め、効率の高い遺伝子導入法の検索が必要であると結論した。

This study は, Leigh syndrome patients exist に す る ミ ト コ ン ド リ ア ATPase6 heritage 伝 son の T - point C - different cases を like に, patient origin cells を using seaborne い た in vivo be 験 を line っ て heritage 伝 son repair す る た め の way を establish す る こ と を purpose と し て い る. Youdaoplaceholder1 れまでに, the patient 's cells are derived from whole DNA and whole RNAある ある ある in Vitro で modulation し た variations over different を hold つ の ATPase6 - mRNA を タ ー ゲ ッ ト に salt base with column specific な photochemical off ア ミ ノ を try み, ヘ ア ピ ン type CVU contains ODN を with い た site specific な C の ア off ミ ノ change が may で あ る こ と を shown し た. RNA の は repair services rate, the in vitro で synthetic し た span の ATPase 6 - mRNA を タ ー ゲ ッ ト し た occasions は 10.8%, Leigh sufferer 脳 origin の 7.6% RNA の occasions は で あ っ た. With others in this year's は in vivo で の RNA repair を confirm す る た め, ヘ ア ピ ン type CVU contains ODN を patients に import し, RNA in the cell repair の presence of を adjustable べ る こ と に を purpose be 験 を line っ た. ま ず, sterile state で の UV ZhaoSheFa を beg す 検 る た め, others 々 な conditions で cell cultures を interface し た ア off ミ ノ change を try み た と こ ろ, ス ラ イ ド グ ラ ス を interface し て line UV irradiation を っ に た occasions, most も salt base displacement の sharper rate high が い こ と が shown さ れ た. The <s:1> <s:1> result ら ら, and the subsequent <s:1> experiment に ガラスボトムディッシュ ガラスボトムディッシュ ガラスボトムディッシュ:ホ に <s:1> with a diameter of 27mmを, を た た. Lead き 続 き, Leigh sufferer 脳 origin の original culture line d bud cells に ヘ ア ピ ン に ヘ ア ピ ン type CVU contains ODN を after import, UV irradiation を っ て RNA の repair を み, RFLP に よ っ て ア off ミ ノ change を confirm し た. <s:1> <s:1>, RNA <s:1> repair く complete く recognition められな められな った った. GFP プ ラ ス ミ ド を index と し て confirm し た と こ ろ, the cultured cells は posthumous son 伝 import high rate of unseen が い と さ れ る Lipofectamine LTX や FuGENE 6 に よ っ て も posthumous son 伝 が import さ れ な か っ た こ と か ら, today back to の - different repair の failure は ODN の import が sharper rate extremely め て low い こ と が reason で あ る と exam え ら れ た. In the future, the introduction method of physics will mainly include め, and the efficient <s:1> high-efficiency 伝 particle introduction method <e:1> 検 will seek が necessary であると conclusions た た.

项目成果

Protected DNA Probes' capable of strong hybridization without removal of base protecting groups

受保护的 DNA 探针能够进行强杂交，无需去除碱基保护基团

• 发表时间: 2008
• 期刊: Nucleic Acids Res. 36
• 作者: Ohkubo A;Kasuya R;Sakamoto K;Miyata K;Taguchi H;Nagasawa H;Tsukahara T;Watanobe T;Maki Y;Seio K;Sekine M
• 通讯作者: Sekine M

'Protected DNA Probes' capable of strong hybridization without removal of base protecting groups.

“受保护的 DNA 探针”能够进行强杂交，无需去除碱基保护基团。

• 发表时间: 2008
• 期刊: Nucleic Acids Res. 36
• 作者: Ohkubo A;Kasuya R;SakamotoK;Miyata K;Taguchi H;Nagasawa H;Tsukahara T;WatanobeT;Maki Y;Seio K;Sekine M
• 通讯作者: Sekine M

Change of Expression of ACTNl and Sr3A Genes During Early Stage of Neural Differentiation in P19 Cells

P19细胞神经分化早期ACTN1和Sr3A基因表达变化

• 发表时间: 2008
• 作者: Alam;A. H. M. K;Suzuki H;sukahara T
• 通讯作者: sukahara T

Localization of c-mos mRNA around the animal pole in the zebrafish oocyte with Zor-1/Zorba.

使用 Zor-1/Zorba 将 c-mos mRNA 定位在斑马鱼卵母细胞动物极周围。

• 发表时间: 2009
• 期刊: BioScience Trends 3(In press)
• 作者: Suzuki;Tsukaha;T;Inoue K.
• 通讯作者: Inoue K.

神経細胞特異的な選択的スプライシングの網羅的解析

神经元特异性选择性剪接的综合分析

• 发表时间: 2008
• 作者: 佐野塚原俊文;鈴木仁
• 通讯作者: 鈴木仁