Elucidation of the pathogenesis of implantation failure for novel treatment development focusing on extracellular secretory granules derived from preimplantation embryos and uterine endometrium

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計画概要の1. 　 マーモセットの雌性生殖器内の細菌叢とエクソソームの解析マーモセットの採卵（開腹手術）の際に、無菌的に左右卵管、子宮体部、子宮頸管をそれぞれ穿刺し、少量の培養液を注入後すぐに吸引して内腔の洗浄液を回収した。遠心後沈渣は細菌叢の解析に供し、上清は(マイクロ)エクソソームの解析に供した。DNA抽出後全ゲノム増幅を試みたが、予備実験として行った5体のサンプルのうち、1個体からはDNAが増幅されず、4個体から十分なDNA量が増幅され、NGSを用いた16S rRNA遺伝子シークエンスに供した。その結果、細菌を検出することができたのは2個体についてのみであった。そこで、マーモセット子宮内の着床前期胚を膣から上行性に回収する操作の際に得られる子宮内膜組織片をサンプルとしたところ、21検体全てから16S rRNA遺伝子細菌叢の結果が得られた。現在はそれらの結果のデータ解析中である。計画概要の4. および5. ヒト胚盤胞培養に使用した後の培養液のEMV解析とART臨床データの解析顕微授精後に1個の受精卵を30-ul dropに入れ、培養液を交換せず培養して形態良好胚盤胞が得られた場合に、使用済み培養液を回収し、胚それぞれについて凍結保存した（~25 ul）。その後移植され妊娠に至った胚が由来する培養液群（妊娠群）、妊娠に至らなかった胚の由来する培養液（非妊娠群）、胚を入れないコントロール培養液についてmiRNA網羅的解析を行い、各群に特異的なmiRNAを抽出した。さらに、サンプルをプールしないで、それぞれの胚の培養液(~25ul)中の miRNA発現量についてリアルタイムqPCRを用いて解析した。その結果、培養液中の5つのmiRNAの発現量に注目することで、その胚を胚移植した場合に妊娠する可能性を予測できることが明らかとなった (Kamijo S, Hamatani T, et al. Reprod Biol Endocrinol. 2022)。