Biophysics of higher-order molecular genome structure

本年度においては、現在出芽酵母ゲノムに限定されているHi-CO法の測定対象を、ヒトゲノムに拡張するための技術の開発を主に進めた。Hi-CO法では、細胞内のゲノムの近接するヌクレオソーム間において連結を行った後、連結領域を含むDNA産物を回収して次世代シーケンサーで解析することで、近接したゲノム領域のペア情報を網羅的に取得する。ゲノムサイズが250倍大きなヒトゲノムを解析することを目指して、各反応プロセスの最適化を進めるのと共に、DNA産物の回収効率を高めるための様々な検討を行った。特に、連結反応を行う前に行うゲノムの化学架橋の条件の検討を行った。これまでは一般的な化学架橋剤である、DNA-DNAやDNA-タンパク質間を結合させるホルムアルデヒドを使用してきたが、タンパク質-タンパク質間を結合させる化学架橋剤や、スペーサーアームの長さが異なる架橋剤について検討を行い、ヌクレオソーム間の結合効率を最適化した。その一方で、ヌクレオソームを核内で結合するプロセスの検討を行った。これまでは、内在するヌクレオソームをヒストン抗体で免疫沈降した後に、近接するヌクレオソーム同士を結合させていたが、免疫沈降のステップを省略することにより、回収効率を大幅に改善した。さらには、酵素の細胞膜・核膜透過性を高めるために界面活性剤の条件検討を行うのと共に、ゲノム領域間の連結を行う際に付加するDNAアダプターの連結反応条件の最適化を行った。上記の検討により変更したプロトコルを用いて、ヒト胎児性肺由来IMR-90細胞内のゲノムの構造を解析した結果、得られたDNA産物の55%が有効な連結したゲノムであることが示され、構造解析に十分なDNA産物と連結情報を得られることが確認できた。

本年度においては、現在出芽酵母ゲノムに限定されているHi-CO法の測定対象を、ヒトゲノムに拡張するための技術の開発を主に進めた。Hi-CO法では、細胞内のゲノムの近接するヌクレオソーム間において連結を行った後、連結領域を含むDNA産物を回収して次世代シーケンサーで解析することで、近接したゲノム領域のペア情報を網羅的に取得する。ゲノムサイズが250倍大きなヒトゲノムを解析することを目指して、各反応プロセスの最適化を進めるのと共に、DNA産物の回収効率を高めるための様々な検討を行った。特に、連結反応を行う前に行うゲノムの化学架橋の条件の検討を行った。これまでは一般的な化学架橋剤である、DNA-DNAやDNA-タンパク質間を結合させるホルムアルデヒドを使用してきたが、タンパク質-タンパク質間を結合させる化学架橋剤や、スペーサーアームの長さが異なる架橋剤について検討を行い、ヌクレオソーム間の結合効率を最適化した。その一方で、ヌクレオソームを核内で結合するプロセスの検討を行った。これまでは、内在するヌクレオソームをヒストン抗体で免疫沈降した後に、近接するヌクレオソーム同士を結合させていたが、免疫沈降のステップを省略することにより、回収効率を大幅に改善した。さらには、酵素の細胞膜・核膜透過性を高めるために界面活性剤の条件検討を行うのと共に、ゲノム領域間の連結を行う際に付加するDNAアダプターの連結反応条件の最適化を行った。上記の検討により変更したプロトコルを用いて、ヒト胎児性肺由来IMR-90細胞内のゲノムの構造を解析した結果、得られたDNA産物の55%が有効な連結したゲノムであることが示され、構造解析に十分なDNA産物と連結情報を得られることが確認できた。