Function of the new open reading frame appeared by cytoplasmic splicing in plants

植物细胞质剪接出现的新开放阅读框的功能

基本信息

批准号：
20H02950
负责人：
小泉望
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Osaka Metropolitan University (2022-2023)Osaka Prefecture University (2020-2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

小胞体ストレス応答では、bZIP60u mRNAの細胞質スプライシングが起こり、通常小胞体膜に存在するbZIP60が、ストレス条件下では細胞質スプライシングの結果、翻訳されたｂZIP60は膜貫通ドメインを失い、核へ移行し転写因子として働く。さらに新たな読み枠ORF2が生じる。トランジェントアッセイの結果、ORF2がbZIP60の転写活性を上昇させることが示唆された。そこでORF2がbZIP60の転写活性を高めるメカニズムの解明を目的とし、「ORF2が持つ核移行シグナル(NLS)がbZIP60sの核移行を促進する可能性」と「ORF2が他のタンパク質と相互作用する可能性」を念頭に実験を行った。GFPと欠失あるいは変異を持つORF2の融合タンパク質を発現るするBY-2細胞株を作出し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてGFP蛍光の細胞内局在を観察したところ、トランジエントアッセイで見られた転写活性の差は核局在以外の要因に起因すると考えられた。タグを付加したbZIP60sあるいはORF2を欠くbZIP60ΔCを発現する形質転換シロイヌナズナを作出し、bZIP60sあるいはORF2を欠くbZIP60と相互作用するタンパク質を質量分析により同定、比較することでORF2に特異的に結合するタンパク質を同定することを計画した。常に活性型bZIP60であるbZIP60sを過剰発現する植物の作出は困難であるため、ツニカマイシン（Tm）処理によりbZIP60あるいはbZIP60ΔCが発現するように計画した。またタンパク質をトラップするために３つのタグを付加したbZIP60の発現を試みた。その結果、Tm処理によるスプライシングが起きていることは確認されたが、ウエスタンブロットではbZIP60のシグナルは検出されたものの、Tmの有無でタンパク質の分子量には違いが見られなかった。

In the endoplasmic reticulum stress response, cytoplasmic splicing of bZIP60u mRNA occurs, and bZIP60, which is normally present in the endoplasmic reticulum membrane, is a result of cytoplasmic splicing under stress conditions, and the translated bZIP60 loses its transmembrane domain, translocates to the nucleus, and acts as a transcription factor.还创建了一个新的阅读框架ORF2。瞬态测定表明ORF2增加了BZIP60的转录活性。因此，为了阐明ORF2增加BZIP60的转录活性的机制，我们进行了实验，并可能“ ORF2的核转运信号（NLS）促进BZIP60S的核转运”和“ ORF2与其他蛋白质相互作用的可能性”。产生了表达具有缺失或突变的GFP和ORF2融合蛋白的By-2细胞系，并使用共聚焦激光显微镜观察到GFP荧光的亚细胞定位。据认为，在瞬时测定中看到的转录活性差异是由于核定位以外的其他因素所致。转化的拟南芥表达缺乏标记的BZIP60或ORF2的BZIP60ΔC，以及通过识别和比较与BZIP60S或BZIP60相互作用的蛋白质，或者缺乏BZIP60S或ORF2的BZIP60，我们计划识别与ORF2专门结合的蛋白质。由于很难产生过表达BZIP60的植物，因此很难产生植物，因此BZIP60或BZIP60ΔC的设计被设计为被皮霉素（TM）表达。我们还尝试用添加三个标签来捕获蛋白质的BZIP60表达BZIP60。结果，已经证实了通过TM处理发生的剪接，但是尽管在蛋白质印迹中检测到BZIP60的信号，但在存在TM的存在或不存在的情况下，蛋白质的分子量没有差异。