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Function of the new open reading frame appeared by cytoplasmic splicing in plants

植物细胞质剪接出现的新开放阅读框的功能

基本信息

批准号：
20H02950
负责人：
小泉望
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Osaka Metropolitan University (2022-2023)Osaka Prefecture University (2020-2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

小胞体ストレス応答では、bZIP60u mRNAの細胞質スプライシングが起こり、通常小胞体膜に存在するbZIP60が、ストレス条件下では細胞質スプライシングの結果、翻訳されたｂZIP60は膜貫通ドメインを失い、核へ移行し転写因子として働く。さらに新たな読み枠ORF2が生じる。トランジェントアッセイの結果、ORF2がbZIP60の転写活性を上昇させることが示唆された。そこでORF2がbZIP60の転写活性を高めるメカニズムの解明を目的とし、「ORF2が持つ核移行シグナル(NLS)がbZIP60sの核移行を促進する可能性」と「ORF2が他のタンパク質と相互作用する可能性」を念頭に実験を行った。GFPと欠失あるいは変異を持つORF2の融合タンパク質を発現るするBY-2細胞株を作出し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてGFP蛍光の細胞内局在を観察したところ、トランジエントアッセイで見られた転写活性の差は核局在以外の要因に起因すると考えられた。タグを付加したbZIP60sあるいはORF2を欠くbZIP60ΔCを発現する形質転換シロイヌナズナを作出し、bZIP60sあるいはORF2を欠くbZIP60と相互作用するタンパク質を質量分析により同定、比較することでORF2に特異的に結合するタンパク質を同定することを計画した。常に活性型bZIP60であるbZIP60sを過剰発現する植物の作出は困難であるため、ツニカマイシン（Tm）処理によりbZIP60あるいはbZIP60ΔCが発現するように計画した。またタンパク質をトラップするために３つのタグを付加したbZIP60の発現を試みた。その結果、Tm処理によるスプライシングが起きていることは確認されたが、ウエスタンブロットではbZIP60のシグナルは検出されたものの、Tmの有無でタンパク質の分子量には違いが見られなかった。

The results of cytoplasmatic transformation of bZIP 60u mRNA in the presence of bZIP 60 in the cytoplasm of small cell membrane were as follows: 1. The new ORF2 was created. As a result, ORF2 and bZIP60 increased in activity. The idea of "ORF2 has the potential to promote nuclear migration (NLS) of bZIP 60s" and "ORF2 has the potential to interact with other molecules" was put forward. The GFP gene expression was detected by confocal microscopy in the BY-2 cell line, and the difference in ORF gene expression was detected by fluorescence microscopy. BZIP60s is the most important part of ORF 2. BZIP 60ΔC is the most important part of ORF 2. BZIP60s is the most important part of ORF 2. BZIP 60 s is the most important part of ORF 2. BZIP60 interacts with ORF 2. The plant has difficulty in producing active bZIP60 and bZIP60. The quality of the product is very high, and the production of bZIP60 is very difficult. As a result, Tm treatment was carried out in the presence or absence of BZIP60 and its molecular weight was determined.