Function of the new open reading frame appeared by cytoplasmic splicing in plants

植物细胞质剪接出现的新开放阅读框的功能

• 批准号: 20H02950
• 负责人: 小泉 望
• 金额: $ 11.32万
• 依托单位: Osaka Metropolitan University (2022-2023)Osaka Prefecture University (2020-2021)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H02950/
• 关键词: 小胞体ストレス応答; 細胞質スプライシング; 転写因子; bZIP型転写因子; シロイヌナズナ; ルシフェラーゼアッセイ; GFP; 細胞内局在

小胞体ストレス応答では、bZIP60u mRNAの細胞質スプライシングが起こり、通常小胞体膜に存在するbZIP60が、ストレス条件下では細胞質スプライシングの結果、翻訳されたｂZIP60は膜貫通ドメインを失い、核へ移行し転写因子として働く。さらに新たな読み枠ORF2が生じる。トランジェントアッセイの結果、ORF2がbZIP60の転写活性を上昇させることが示唆された。そこでORF2がbZIP60の転写活性を高めるメカニズムの解明を目的とし、「ORF2が持つ核移行シグナル(NLS)がbZIP60sの核移行を促進する可能性」と「ORF2が他のタンパク質と相互作用する可能性」を念頭に実験を行った。GFPと欠失あるいは変異を持つORF2の融合タンパク質を発現るするBY-2細胞株を作出し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてGFP蛍光の細胞内局在を観察したところ、トランジエントアッセイで見られた転写活性の差は核局在以外の要因に起因すると考えられた。タグを付加したbZIP60sあるいはORF2を欠くbZIP60ΔCを発現する形質転換シロイヌナズナを作出し、bZIP60sあるいはORF2を欠くbZIP60と相互作用するタンパク質を質量分析により同定、比較することでORF2に特異的に結合するタンパク質を同定することを計画した。常に活性型bZIP60であるbZIP60sを過剰発現する植物の作出は困難であるため、ツニカマイシン（Tm）処理によりbZIP60あるいはbZIP60ΔCが発現するように計画した。またタンパク質をトラップするために３つのタグを付加したbZIP60の発現を試みた。その結果、Tm処理によるスプライシングが起きていることは確認されたが、ウエスタンブロットではbZIP60のシグナルは検出されたものの、Tmの有無でタンパク質の分子量には違いが見られなかった。

Small cell body ス ト レ ス 応 answer で は, bZIP60u mRNA の cytoplasm ス プ ラ イ シ ン グ が up こ り exist, usually small cell body membrane に す る bZIP60 が, ス ト レ ス conditions で は cytoplasm ス プ ラ イ シ ン グ の results, double 訳 さ れ た bZIP60 は transmembrane ド メ イ ン を い loss, nuclear へ transitional し planning write factor と し て 働 く. Youdaoplaceholder0 new たな読み枠ORF2が student じる. ト ラ ン ジ ェ ン ト ア ッ セ イ の results and ORF2 が bZIP60 の planning write activity を rise さ せ る こ と が in stopping さ れ た. そ こ で ORF2 が bZIP60 の planning write high active を め る メ カ ニ ズ ム の interpret を purpose と し, "ORF2 が hold つ nuclear migration シ グ ナ ル (NLS) が bZIP60s の nuclear migration を promote す る possibility" と "ORF2 が he の タ ン パ ク qualitative と interaction す る possibility" を thought に be 験 を line っ た. GFP と owe lost あ る い は - different を hold つ ORF2 の fusion タ ン パ ク qualitative を 発 now る す る BY - 2 cell lines を make し, total focus レ ー ザ ー 顕 micromirror を with い て GFP 蛍 light の cells inside bureau in を 観 examine し た と こ ろ, ト ラ ン ジ エ ン ト ア ッ セ イ で see ら れ た poor planning write activity の は outside the nucleus (の cause BY に す る と exam え ら れ Youdaoplaceholder0. タ グ を plus し た bZIP60s あ る い は ORF2 を owe く bZIP60 Δ C を 発 now す る form quality planning in シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ を し, bZIP60s あ る い は ORF2 を owe く bZIP60 と interaction す る タ ン パ ク qualitative を quality analysis に よ り compared to fixed, す る こ と で ORF2 に specific に combining す Youdaoplaceholder0, パ, パ and を work together on する, た, とを and <s:1> た. に activity type bZIP60 で あ る bZIP60s を before turning 発 now す の る plants make は difficult で あ る た め, ツ ニ カ マ イ シ ン (Tm) 処 Richard に よ り bZIP60 あ る い は bZIP60 Δ C が 発 now す る よ う に project し た. Youdaoplaceholder0, パ, パ, duroid をトラップするために3, タグを, タグを, <s:1>, た, bZIP60, を, みた. そ の results, Tm 処 に よ る ス プ ラ イ シ ン グ が up き て い る こ と は confirm さ れ た が, ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト で は bZIP60 の シ グ ナ ル は 検 out さ れ た も の の, Tm の presence of で タ ン パ ク qualitative の molecular weight に は violations い が see ら れ な か っ た.

项目成果

小胞体ストレス応答

内质网应激反应

変異型種子貯蔵タンパク質を発現するシロイヌナズナの作出と解析

表达突变种子储存蛋白的拟南芥的产生和分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 成田 裕貴，岡田 龍之介，松盛 巧，山田 黎，岩田 雄二，小泉 望

小胞体ストレス応答によって転写因子bZIP60に生じるORF2の機能解析

内质网应激反应转录因子bZIP60产生的ORF2的功能分析

• 发表时间: 2022
• 作者: RAHMAN;A;溝口 裕之，辻 雄貴，坂上 友祐，舟引 萌香，岩田 雄二，小泉 望
• 通讯作者: 溝口 裕之，辻 雄貴，坂上 友祐，舟引 萌香，岩田 雄二，小泉 望