糖制御プロモーターを用いた植物培養細胞による有用タンパク質の効率的分泌生産法の確立

利用糖调节启动子建立使用培养植物细胞有效分泌生产有用蛋白质的方法

基本信息

批准号：
04F04220
负责人：
小泉望
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ワクチンなどの有用タンパク質を生産する系として植物培養細胞が考えられる。タンパク質糖鎖の構造改変を念頭に置いた場合には、シロイヌナズナズナが現実的な植物材料である。しかし、シロイヌナズナ培養細胞におけるタンパク質生産法の報告は無い。一方、イネ培養細胞ではアルファ-アミラーゼのプロモーター、シグナルペプチドを用いた培地の糖濃度による分泌生産制御系が知られている。そこで、本研究では1、「シロイヌナズナにおける糖制御プロモーターの利用によるタンパク質の分泌生産法の確立」を試みた。並行して2、「恒常的に働くCaMV35Sプロモーターを用いた生産系の確立」もおこなった。1については、糖欠乏処理をおこなった培養細胞の培地に分泌されるタンパク質を質量分析によりおこない本研究で用いているβガラクトシダーゼが実際に糖欠乏依存的に培地に分泌されている事を確認した。このβガラクトシダーゼのプロモーターとシグナルペプチドに抗体遺伝子(具体的な遺伝子名は特許申請の関係から明記しない)を連結し、培養細胞に導入した。この形質転換培養細胞に糖欠乏処理を行なったが目的の抗体の生産は見られなかった。遺伝子の発現量が充分でなかった可能性が考えられる。一方、2についてはCaMV35Sプロモーターの下流に翻訳効率を上げる非翻訳領域の配列と抗体遺伝子を連結したキメラ遺伝子を培養細胞に導入した。複数の形質転換培養細胞株から目的抗体タンパク質を発現している細胞株をウエスタンブロットにより選抜した。それらの細胞株の液体培養をおこなったところ培地に目的の抗体タンパク質が分泌されており、シロイヌナズナ培養細胞で有用タンパク質の分泌生産に成功したことが確認された。

生产有用蛋白质（例如疫苗）的系统被认为是植物培养的细胞。当考虑蛋白质聚糖的结构修饰时，拟南芥是一种现实的植物材料。但是，尚未有关于拟南芥培养细胞中蛋白质生产方法的报道。另一方面，在水稻培养的细胞中，基于培养基的糖浓度使用启动子和信号肽的分泌生产控制系统是已知的。因此，在这项研究中，我们试图通过在拟南芥中使用糖调节的启动子来建立一种分泌蛋白质的方法。同时，还进行了2，“使用不断工作的CAMV35启动子建立生产系统”。关于1，通过质谱法进行了经过糖耗竭治疗的培养细胞中分泌的蛋白质，并证实，这项研究中使用的β-半乳糖苷酶实际上以糖消耗依赖性方式分泌到培养基中。抗体基因（由于专利应用而未指定特定基因名称）与该β-半乳糖苷酶的启动子和信号肽相关，并引入培养细胞中。转化的培养细胞用糖剥夺处理，但未观察到所需抗体的产生。基因表达水平可能不够。另一方面，对于2，一个嵌合基因，其中提高翻译效率和抗体基因的未翻译区域的序列与未翻译区域的序列相关联，该序列提高了翻译效率的序列。通过蛋白质印迹从多个转化的培养细胞系中选择表达靶抗体蛋白的细胞系。当这些细胞系在液体中培养时，将靶抗体蛋白分泌在培养基中，并证实有用蛋白的分泌成功地在拟南芥培养的细胞中产生。