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ジストロフィンmRNA前駆体のスプライシング促進配列に結合する核タンパクに関する研究

抗肌营养不良蛋白前体mRNA剪接促进序列结合核蛋白的研究

基本信息

批准号：
02F00252
负责人：
松尾雅文
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00252/
关键词：
DMD dystrophin splicing RNA binding protein

项目摘要

ジストロフィン遺伝子から転写されたmRNA前駆体は100kb以上もの巨大イントロンを有しており、そのスプライシングは非常に精密に制御されているものと考えられる。しかし、その機構を分子細胞生物学的手法を用いて明らかにした報告はない。本研究は、ジストロフィンmRNA前駆体に結合する核タンパクを分離精製し、その遺伝子をクローニングするとともに、発現させたタンパクを用いてスプライシング制御機序を明らかにするものである。ジストロフィン遺伝子の79のエクソンの中でエクソン19にスプライシング促進配列があることが明らかにされている。本研究では、まずエクソン19のスプライシング促進配列に結合する核タンパクの分離精製を行った。31塩基からなるエクソン19のスプラシシング促進配列からなるFAMラベルしたRNAプローブを作製した。これをHeLa細胞核抽出液と混ぜRNA・タンパク複合体をUVクロスリンク法を用いて作製した。さらに、HPLC法と電気泳動法を用いてこの複合体を単一バンドになるまで精製した。そして、この精製したバンドをTOFMAS分析し、プローブに結合した核タンパクの一部のアミノ酸配列を直接明らかにし、その結果からスプライシング促進配列に結合するタンパクの同定に成功した。この分離精製したタンパクのcDNAの全長をスクリーニングし、これをタンパク発現ベクターに組み込んだ。現在、本タンパク質の機能解析をミニ遺伝子を導入したHeLa細胞を応用した分子生物学的手法を用いて行っている。

ジストロフィン缝子から転写されたmRNA pre-embedded body は 100kb or more もの huge イントロンを有しており、そのスプライシングは Very precise control されているものと卡えられる. The techniques of molecular and cell biology are reported by Toshiko and Toshiaki Akira. In this study, the separation and purification of the pre-mRNA pre-mRNA body and the nuclear nuclei were separated and purified.いてスプライシングcontrol machine order を明らかにするものである.ジストロフィン伝子の79のエクソンの中でエクソン19 The にスプライシング promotes the arrangement of the があることが明らかにされている. In this study, the separation and purification of 19 のスプライシング to promote the arrangement and combination of では and まずエクソン19 was carried out. 31婩组からなるエクソン19のスプラシシングpromote arrangement からなるFAMラベルしたRNAプローブをproductionした. HeLa cell nuclear extract solution and mixed RNA・タンパク complex are produced using the UV クロスリンク method. It is a purified compound made of いてこのcomplex and さらに, HPLC method and electrophoresis method.そして, このRefined したバンドをTOFMAS analysis し, プローブに Combined したnuclear タンパクの一のアミノAcid The combination of arrangement and arrangement is direct, and the result of arrangement is the same as the success of arrangement.このIsolated and refined したタンパクのcDNAのfull-length をスクリーニングし, これをタンパク発成ベクターに组み込んだ. Now, the functional analysis of this substance is carried out by introducing it into HeLa cells and using molecular biology techniques.