Analysis of metastasis and growth of melanoma cells under irradiation of specific light exposure with Gq mutation

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虹彩に発生する悪性黒色腫(以下Melanoma)のうち、遠隔転移を起こした群ではGタンパク質ファミリーのうちGqαサブユニット群(以下Gq)の遺伝子変異が高率に認められること、また動物実験により、Gq遺伝子変異株ではMAPキナーゼ系の活性化(細胞増殖の活性化)および有意に転移をきたしたことが報告された。その後、Melanomaのみならず消化器系や呼吸器系に発生した悪性腫瘍においても同様の知見が報告されつつある。本研究の目的は、光とMelanomaの関連においてこれまで示されてきた「光線暴露が発生の危険因子である」ことに加え、「光線暴露は増殖・転移の危険因子でもある」ことを細胞生物学的に示すことにある。われわれは2つのMelanoma細胞株(MEWO株およびG361株)を研究対象として選んだ。昨年度までにGnaqをターゲットにR138Q変異の導入を行うためのCRISPR/CAS9を用いたベクターの配列およびssODNの配列(1塩基置換)を設計した。本年度はこれらをエレクトロポーレーションにより同時にMEWO株およびG361株に導入を行い、変異導入を確認するためにゲノム配列に対してPCRを行い、制限酵素処理ないしはGuide-it Mutation Detection Kitを用いて確認したが、いずれも切断が見られず、変異導入が否定された。次に、guide RNAを合成し、ssODNおよびCAS9タンパクを混じたものをエレクトロポーレーションし、Guide-it Mutation Detection Kitにより切断を確認したところ、MEWO株において一部切断が行われていることが確認でき、つまり、編集が行われたことが確認された。現在、限界希釈法によりクローンのスクリーニングを行なっている。