DNA複製複合体の構造変換による、RNAプライマー鎖長の制御機構の解明

通过DNA复制复合物的结构改造阐明RNA引物链长度的控制机制

• 批准号: 20J12260
• 负责人: 沖 啓輔
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J12260/
• 关键词: アーキア; DNA複製; DNAポリメラーゼ; プライマーゼ; ヘリカーゼ; 超分子複合体

アーキアの複製ポリメラーゼであるPolDが、CMGヘリカーゼ (MCM-GINS-GAN複合体) とプライマーゼのブリッジとなることでレプリソームを形成することを昨年度報告した。そこで、CMGヘリカーゼとPolDの複合体形成に関してさらに詳細な解析を行ったところ、GINSが2分子のPolDと強固に結合することが証明された。次にこの相互作用は、PolDのDP1サブユニットのN末端ドメイン(DP1N)とGINSのGins51サブユニットのC末端ドメイン(Gins51C)との結合によることを示し、DP1N-Gins51C-GAN三者複合体の結晶構造解析を行なった。さらに、DP1N-Gins51Cを介した結合が存在する条件でのみ、PolDがCMG様ヘリカーゼの一本鎖DNA依存性のヘリカーゼ活性を促進することを発見した。すなわち、リーディング鎖上を進行するCMGヘリカーゼにPolDが結合することによって、親DNA二本鎖を解く反応が促進されるという、ヘリカーゼ-ポリメラーゼ間の機能的な相互作用を初めて実験的に証明した。これらの結果をまとめて論文発表を行なった。CMGヘリカーゼとPolDの強固な結合とは対照的に、PolDとプライマーゼの複合体形成はPolD-PCNA-DNA複合体の形成とともに解消される。PolDとプライマーゼの相互作用部位についても詳細な構造解析が必要と考えた。PolDのDP2サブユニットのcPIPを模した合成ペプチドを設計し、精製したPriLのN末端ドメイン (PriLN)と混合して結晶構造解析を行なったところ、PriLNに存在する疎水性ポケットに、ヘリックス構造を形成したDP2cPIPが結合することが明らかとなり、部位特異的変異体を用いた生化学的解析によって複合体の形成における重要性が証明された。これらの結果をまとめて学会発表を行なった。論文投稿準備を進めている。

The first report of the year was published on the basis of the following: A detailed analysis of the relationship between CMG and PolD complex formation and the strong binding between GINS and PolD molecules is presented. The interaction between DP1N and Gins51C of PolD and Gins 51 C of GINS was studied. The crystal structure of DP1N-Gins51C-GAN complex was analyzed. In addition, DP1 N-Gins51C can promote the activity of CMG in the presence of binding conditions. The interaction between CMG and PolD is proved to be the first step in the process of DNA binding. The results of this paper are presented in the table below. CMG, PolD, PCN-DNA complex formation, PolD, PCN-DNA complex formation, PCN-DNA complex dissolution Pold The importance of the chemical analysis of DP2cPIP in the design, refinement and application of site-specific variants in the formation of complexes has been demonstrated. The result of this study is that the students learn how to do it. Paper submission preparation is in progress.

项目成果

超好熱性アーキア Thermococcus kodakarensisのレプリソームにおけるPolD上でのプライマーゼからPCNAへの置換による機能変換

在超嗜热古菌 Thermococcus kodakarensis 的复制体中用 PCNA 取代 PolD 上的引物酶进行功能转换

• 发表时间: 2021
• 作者: 沖啓輔;山上健;永田麻梨子;真柳浩太;白井剛;安達成彦;沼田倫征;松本俊介;石野園子;石野良純
• 通讯作者: 石野良純

Two conformations of DNA polymerase D-PCNA-DNA complex in a hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis.

超嗜热古菌 Thermococcus kodakarensis 中 DNA 聚合酶 D-PCNA-DNA 复合物的两种构象。

• 发表时间: 2020
• 作者: 沖啓輔，真柳浩太，宮崎直幸，石野園子，山上健，森川耿右，岩崎憲治;神田大輔，白井剛，石野良純
• 通讯作者: 神田大輔，白井剛，石野良純

Family D DNA polymerase interacts with GINS to promote CMG-helicase in the archaeal replisome.

• DOI: 10.1093/nar/gkab799
• 发表时间: 2022-04-22
• 期刊: NUCLEIC ACIDS RESEARCH
• 影响因子: 14.9
• 作者: Oki, Keisuke;Nagata, Mariko;Yamagami, Takeshi;Numata, Tomoyuki;Ishino, Sonoko;Oyama, Takuji;Ishino, Yoshizumi
• 通讯作者: Ishino, Yoshizumi

Structural and functional analysis of the interaction between family D-DNA polymerase and CMG-like helicase in the replisome of Thermococcus kodakarensis

柯达热球菌复制体中 D-DNA 家族聚合酶与 CMG 样解旋酶相互作用的结构和功能分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 沖 啓輔;永田麻梨子;山上 健;沼田倫征;石野園子;大山拓 次;石野良純
• 通讯作者: 石野良純