DNA複製複合体の構造変換による、RNAプライマー鎖長の制御機構の解明

通过DNA复制复合物的结构改造阐明RNA引物链长度的控制机制

基本信息

批准号：
20J12260
负责人：
沖啓輔
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

アーキアの複製ポリメラーゼであるPolDが、CMGヘリカーゼ (MCM-GINS-GAN複合体) とプライマーゼのブリッジとなることでレプリソームを形成することを昨年度報告した。そこで、CMGヘリカーゼとPolDの複合体形成に関してさらに詳細な解析を行ったところ、GINSが2分子のPolDと強固に結合することが証明された。次にこの相互作用は、PolDのDP1サブユニットのN末端ドメイン(DP1N)とGINSのGins51サブユニットのC末端ドメイン(Gins51C)との結合によることを示し、DP1N-Gins51C-GAN三者複合体の結晶構造解析を行なった。さらに、DP1N-Gins51Cを介した結合が存在する条件でのみ、PolDがCMG様ヘリカーゼの一本鎖DNA依存性のヘリカーゼ活性を促進することを発見した。すなわち、リーディング鎖上を進行するCMGヘリカーゼにPolDが結合することによって、親DNA二本鎖を解く反応が促進されるという、ヘリカーゼ-ポリメラーゼ間の機能的な相互作用を初めて実験的に証明した。これらの結果をまとめて論文発表を行なった。CMGヘリカーゼとPolDの強固な結合とは対照的に、PolDとプライマーゼの複合体形成はPolD-PCNA-DNA複合体の形成とともに解消される。PolDとプライマーゼの相互作用部位についても詳細な構造解析が必要と考えた。PolDのDP2サブユニットのcPIPを模した合成ペプチドを設計し、精製したPriLのN末端ドメイン (PriLN)と混合して結晶構造解析を行なったところ、PriLNに存在する疎水性ポケットに、ヘリックス構造を形成したDP2cPIPが結合することが明らかとなり、部位特異的変異体を用いた生化学的解析によって複合体の形成における重要性が証明された。これらの結果をまとめて学会発表を行なった。論文投稿準備を進めている。

去年，我们报道了弓形复制性聚合酶Pold是CMG解旋酶（MCM-GINS-GAN复合物）和原始酶之间的桥梁，形成了一个重建体。因此，对CMG解旋酶和POLD的复合形成的进一步详细分析表明，杜松子牢固地结合了两个分子的Pold。然后，通过结合了POLD（DP1N）的DP1亚基的N末端结构域与GINS51亚基的C末端结构域（GINS51C）（GINS51C）的C末端结构域与DP1N-GINS51C-GAN TripArte综合体的DP1N-GINS51C-GAN三级复合物的晶体结构分析来证明这种相互作用。此外，我们发现仅在DP1N-GINS51C介导的结合的情况下，POLD才能促进单链DNA依赖性解旋酶活性。换句话说，我们在实验上首次在实验上证明了解旋酶 - 聚合酶之间的功能相互作用，其中POLD与铅链上的CMG解旋酶结合，这促进了揭示父母DNA双链的反应。这些结果总结并发表了一篇论文。与CMG解旋酶和Pold的鲁棒结合相反，Pold和Primase的复合形成与Pold-PCNA-DNA复合物的形成分解。我们还认为，必须对Pold和Primase之间的相互作用位点进行详细的结构分析。 A synthetic peptide mimicking the cPIP of the DP2 subunit of PolD was designed and mixed with the purified N-terminal domain (PriLN) of PriL and crystal structure analysis revealed that DP2cPIP, which formed a helix structure, binds to the hydrophobic pocket present in PriLN, and biochemical analysis using site-directed mutants proved its importance in complex formation.这些结果总结并在会议上呈现。我们准备提交论文。

项目成果

期刊论文数量（7）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

超好熱性アーキア Thermococcus kodakarensisのレプリソームにおけるPolD上でのプライマーゼからPCNAへの置換による機能変換

在超嗜热古菌 Thermococcus kodakarensis 的复制体中用 PCNA 取代 PolD 上的引物酶进行功能转换

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
沖啓輔;山上健;永田麻梨子;真柳浩太;白井剛;安達成彦;沼田倫征;松本俊介;石野園子;石野良純
通讯作者：
石野良純

Family D DNA polymerase interacts with GINS to promote CMG-helicase in the archaeal replisome.

DOI：
10.1093/nar/gkab799
发表时间：
2022-04-22
期刊：
NUCLEIC ACIDS RESEARCH
影响因子：
14.9
作者：
Oki, Keisuke;Nagata, Mariko;Yamagami, Takeshi;Numata, Tomoyuki;Ishino, Sonoko;Oyama, Takuji;Ishino, Yoshizumi
通讯作者：
Ishino, Yoshizumi