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酵素の基質誤認識を誘起するペプチドの創製

创建诱导酶底物错误识别的肽

基本信息

批准号：
20J23653
负责人：
米村開
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

巨大菌由来のシトクロムP450BM3（P450BM3）は、長鎖脂肪酸の水酸化で極めて高い触媒活性を示す。その高い触媒活性からP450BM3はベンゼンなどの非天然基質の水酸化反応への応用が期待されるが、基質認識部位が長鎖脂肪酸の取り込みに最適化されているため、それ以外の基質に対する活性は低い。一方、当研究室は、長鎖脂肪酸と似た構造を有しながらも鎖長の短い分子、擬似基質を添加すると、野生型P450BM3が非天然基質を水酸化することを明らかにしている。本申請課題では、擬似基質の作用機序を解明し、擬似基質が引き出すP450BM3の非天然活性を極限まで高めることを目指した。分子間の相互作用を視覚的に明らかにするため、P450BM3、擬似基質、種々の非天然基質の共結晶を作製し解析した。それらの比較から、ヘム上部の空間は基質に合わせて大きさを変化させられることが分かった。擬似基質添加下において種々の非天然基質が水酸化されるのは、この空間の柔軟性によるものと推察される。また、等温滴定型カロリメトリーによる実験からは、長鎖脂肪酸と擬似基質のP450BM3への取り込みの駆動力が同じであり、既存の擬似基質は長鎖脂肪酸をよく模擬していることが分かった。以上より、ヘム上部には非天然基質を取り込むに十分な空間が存在し、擬似基質は長鎖脂肪酸を模擬していることが明らかにできた。一方、擬似基質存在下での非天然基質に対する活性は天然基質に対するものと比較すると大幅に低い。そこで、擬似基質ではなく反応条件に着目して活性の向上を狙ったところ、攪拌効率の向上により酵素活性が3倍以上となった。本研究では、シトクロムP450BM3の基質認識を構造生物学的観点と熱力学的観点の両面から明らかにし、酵素活性を高める反応条件を決定した。本研究で得られた成果は、P450の利用と応用の範囲の拡大に大きく貢献すると期待できる。

The origin of giant bacteria P450BM 3 (P450BM 3) shows high catalytic activity in the acidification of long-chain fatty acids. P450BM3 has high catalytic activity and low catalytic activity against non-natural substrates. A long chain of fatty acids in the wild type P450BM3 was found to be structurally similar to that in the wild type P450BM3. The subject of the present application is to clarify the mechanism of action of a pseudo-matrix and to indicate the limits of the unnatural activity of a pseudo-matrix derived P450BM3. Molecular interaction analysis of visible light, P450BM3, pseudo-matrix, seed and non-natural matrix co-crystallization The upper part of the space is divided into two parts. Under the condition of artificial matrix addition, the non-natural matrix can be acidified, and the flexibility of the space can be improved. The isothermal titration type of fatty acids is similar to that of the P450BM3 matrix. The above is not a natural matrix, but a very large space exists, and a simulated matrix is a long chain fatty acid. The activity of non-natural substrates in the presence of a square or pseudo-substrate is significantly lower than that of natural substrates. The enzyme activity was 3-fold higher than that of the control group under the condition of "quasi-substrate" and "stirring rate." In this study, the substrate understanding of P450BM 3, the structural biology, the thermodynamics and the reaction conditions of enzyme activity are determined. The results of this study are expected to be useful for the development of P450.

项目成果

期刊论文数量（8）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Analysis of the Binding Mode of Dipeptidic Molecules and Non-native Substrates to Cytochrome P450BM3

二肽分子和非天然底物与细胞色素 P450BM3 的结合模式分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
K. Yonemura;S. Ariyasu;H. Sugimoto;S. Matsuoka;O. Shoji
通讯作者：
O. Shoji

TRICKING CYTOCHROME P450BM3: CATALYSIS OF VARIOUS NON-NATIVE SUBSTRATE TRANSFORMATIONS USING DECOY MOLECULES

欺骗细胞色素 P450BM3：使用诱饵分子催化各种非天然底物转化

DOI：
10.21577/0100-4042.20170747
发表时间：
2021
期刊：
Quimica Nova
影响因子：
0.8
作者：
Stanfield Joshua;Suzuki Kazuto;Yonemura Kai;Malewschik Talita;Shoji Osami
通讯作者：
Shoji Osami

Systematic Evolution of Decoy Molecules for the Highly Efficient Hydroxylation of Benzene and Small Alkanes Catalyzed by Wild-Type Cytochrome P450BM3

野生型细胞色素 P450BM3 催化苯和小烷烃高效羟基化的诱饵分子的系统进化

DOI：
10.1021/acscatal.0c01951
发表时间：
2020
期刊：
ACS Catalysis
影响因子：
12.9
作者：
Kai Yonemura;Shinya Ariyasu;Joshua Kyle Stanfield;Kazuto Suzuki;Hiroki Onoda;Chie Kasai;Hiroshi Sugimoto;Yuichiro Aiba;Yoshihito Watanabe;Osami Shoji
通讯作者：
Osami Shoji

ペプチド分子が誘起するシトクロムP450BM3の誤作動による誘起小分子水酸化反応

肽分子诱导细胞色素P450BM3功能失常引起的小分子羟基化反应