Xist RNA dynamics in living cells

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2022年度は、クロマチン動態とヒストン修飾の関係に注目して解析を進めた。本研究ではこれまで、X染色体上の特定の遺伝子領域について、gRNA/dCas9システムを用いて、生細胞内動態（Mean square displacement: MSD）を調べてきた。X染色体不活性化により不活性化されたX染色体では、活性化X染色体上のDNA領域よりも動きが拘束されていた。動態を調べた3か所のDNA領域のうちの1か所は、不活性化X染色体上で転写が活性化されているXist遺伝子近傍にあり、転写阻害剤の添加により動態の拘束が緩和された。したがって転写されている領域では、転写活性化によりクロマチン動態が拘束されていることが示唆された。今年度は、ヒストン修飾のクロマチン動態への影響について、修飾酵素阻害剤の添加により調べた。不活性化X染色体に高度に蓄積されている抑制性ヒストン修飾H3K27me3を除去するため、責任酵素であるEzh1/2阻害剤（DS-3201）を添加して4日間培養した。この処理によりH3K27me3は検出できないレベルまで低下させて、前年度と同様にgRNA/dCas9システムによるDNA領域の動態観察を行った。その結果、H3K27me3を除去した場合でも、不活性X染色体上のDNA領域の動態は拘束されており、変化はほとんど見られなかった。そこで次に、ユークロマチンドメインとヘテロクロマチンドメインの可視化を行い、動態を調べることにした。今年度はクロマチンドメインのライブイメージングを行うための実験系を樹立した。H3K9ac-mintbodyとH3K27me3-mintbodyをHeLa細胞に発現させて、超解像度蛍光顕微鏡を用いてライブイメージングにより検出した。H3K9ac-mintbodyは細胞内安定性が十分ではなかったため、アミノ酸置換による改良を行った。