Molecular analysis of mirror-arabinan present in cell wall polysaccharides of Mycobacteria and its degrading enzymes

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鏡像体アラビナン分解酵素のうち、２種類のEndo型酵素(EndoMA1, EndoMA2)と2種類のExo型酵素(ExoMA1, ExoMA2)の機能解析と、結晶構造解析を進めた。その際、新たに有機合成した基質アナログの有効性が示された。さらに、EndoMA1の結晶構造で発見した新規CBMの金属ナノ粒子(GNP)を用いた解析に着手した。EndoMA1とEndoMA2の基質特異性解析を合成基質を用いて行った。これまで合成に成功していた22糖(A22BβT)に加え、3種類の合成オリゴ糖(A9LT, A8BT, A5BT)を基質として、HPAEC-PADとHPLCを用いた解析により、両酵素の詳細な基質特異性を明らかにすることができた。EndoMA1はEndoMA2より小さなフラグメントを生成すること、EndoMA2は分岐の隣の結合を切断できること、などが分かった。昨年度発見したExoMA2(MA1061)の酵素学的性質や基質特異性も合成基質を用いて詳細に明らかにした。結晶構造解析では、EndoMA1のA9LTとの複合体構造決定に成功した。これにより触媒ドメインの基質認識と触媒機構が明らかになった。EndoMA1の触媒残基はAsp33(求核触媒)とAsp51(酸/塩基触媒)であることが、結晶構造と変異体解析により示された。さらに、C末端側のβ-サンドイッチドメインにD-アラビナンのオリゴ糖が結合していたことから、このドメインが新規な炭水化物結合モジュール(CBM)であることが示唆された。これまでの検討により、EndoMA1を用いて処理したD-アラビナンを結合させたGNPが有効であることが分かっていた。部分分解D-アラビナン結合型GNPを用いたところ、野生型EndoMA1および触媒残基変異体(D51N)が明確な凝集活性を示したことから、CBMが機能することにより多価の結合が起こっていることが示唆された。