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X線結晶解析に基づく白麹菌キシラナーゼの好酸性・耐酸性機構の解明

基于X射线晶体学阐明曲霉木聚糖酶的嗜酸和耐酸机制

基本信息

批准号：
11760054
负责人：
伏信進矢
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

キシラナーゼCの至適pHが大幅に上昇した変異体であるD37NのX線結晶構造解析を行った。その結果、Asn37の側鎖は野生型のAsp側鎖に比べて電子密度が不明瞭になっており、酸・塩基触媒であるGlu170との水素結合が弱くなっていることが示唆された。これは、これまで筆者らが示したキシラナーゼCの好酸性機構を支持するものである。キシラナーゼCの基質結合クレフトの入り口に存在するGlu118の変異体と、D37Nを組み合わせた各種変異体の活性のpH依存性を測定した結果、E118QとE118Aで酸性域の活性が60〜70%程度に低下し、全ての変異体で中性域の活性が120〜230%程度に上昇した。従って、Glu118はキシラナーゼCの好酸性に寄与していることが分かった。キシラナーゼCの基質結合クレフトに存在するTyr10、Phe131、Trp172の各種変異体酵素の活性のpH依存性を測定した結果、Y10F,F131W以外の変異体では、全てのpH域に渡って活性が90〜40%程度に低下したことから、これらの変異は酵素活性そのものに悪影響を与えていると考えられた。しかし、Y10Fでは酸性域のみで活性が90〜30%程度に低下しており、わずかヒドロキシル基一つの違いが本酵素の好酸性に寄与していることが分かった。F131Wでは、興味深いことに、酸性域にある最大活性が1.5倍に上昇していた。131位の側鎖はサイズの大きいTrpの方が周囲の疎水的な環境を維持するために適していると考えられる。キシラナーゼBのAsn43は、キシラナーゼCのAsp37に相当する。これをAspに置換した変異体の活性のpH依存性を測定した結果、中性域のみで活性が80〜30%程度に低下しており、中性キシラナーゼでも酸性キシラナーゼと同様にこの残基が活性のpH依存性を決定していることが明らかになった。

キシラナーゼC の to the appropriate pH が significantly increased した変 variant である D37N の X-ray crystal structure analysis を row った.その results, Asn37 の side lock は wild type のAsp side lock に ratio べて electron density が unknown になっておであるGlu170, acid-based catalyst, and hydrogen-binding water-based catalyst.これは、これまでThe author らがshows したキシラナーゼCのgood acidic organization をsupports するものである.キシラナーゼCの matrix binding クレフトの enter the mouth に presence するGlu118 の変Determination of pH-dependent activity of various allogeneic compounds and D37N combination compounds As a result, the activity of E118Q and E118A in the acidic domain was reduced to a level of 60 to 70%, and the activity of all variants in the neutral domain was increased to a level of 120 to 230%.従って、Glu118はキシラナーゼCの好 acidic に Send and していることが分かった. The results of the determination of the pH dependence of the activity of various alloenzymes such as Tyr10, Phe131, and Trp172 in the matrix-binding クレフトに of キシラナーゼC, and Y10F, F13 Allogeneic products other than 1W, full pH range, low activity level of 90~40%ことから、これらの変different は Enzyme activity そのものに affects を and えていると卡えられた.しかし、Y10F has low activity in the acidic domain of 90~30%. しており、わずかヒドロキシル一つのviolationいがThis enzyme is a good acidic に Send and していることが分かった. F131W has a strong acidity, a deep taste, and an acidic area with a maximum activity of 1.5 times and a rise of 1.5 times. 131-bit side lock はサイズの大きいTrpの方がweek囲の疎水的な environmental をmaintenance するためにsuitable しているとtest えられる.キシラナーゼBのAsn43は, キシラナーゼCのAsp37に quite する. The results of pH-dependent measurement of pH dependence of allogeneic activity and the pH dependence of allogeneic activity were measured, and the activity of neutral domain was lowered to 80~30% level.り、neutral キシラナーゼでもacidic キシラナーゼと同様にこの residual The activity of the base is determined by its dependence on pH.