Structural basis of reaction mechanism and proton pathway of [NiFe]-hydrogenase

[NiFe]-氢化酶反应机制和质子途径的结构基础

• 批准号: 19H00984
• 负责人: 樋口 芳樹
• 金额: $ 29.04万
• 依托单位: University of Hyogo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19H00984/
• 关键词: ヒドロゲナーゼ; プロトン経路; X線結晶解析; 中性子結晶解析; 酸素耐性機構; ラマン分光法; 酵素活性定量法; 酸素耐性酵素; 活性測定法

（1）ヒドロゲナーゼの中性子結晶構造解析：2020年度末に試料調製のための嫌気グローブボックスが故障したが，コロナ禍の影響で部品調達が遅れ，修理が2021年度の夏に完了した．日本原子力開発研究機構・大強度陽子加速器施設（J-PARC）における中性子結晶回折実験のビームタイムの日程に結晶調製を合わすことができず，今年度の回折実験は実施できなかった．一方，昨年見出した「酸化型酵素結晶中のNi-Fe活性部位の構造が歪んでいる分子」について高分解能X線結晶解析による精密化を進展させた．得られたX線構造解析結果は中性子結晶構造解析結果とも矛盾しないことを確認し，現在論文発表準備中である．（2）ヒドロゲナーゼの酸素耐性機構・一般則の確立（分子内の水分子の役割解明）：　新規の酸素耐性酵素である，Citrobacter由来[NiFe]ヒドロゲナーゼに競争阻害剤である一酸化炭素（CO）を結合させてX線結晶構造解析を実施した．本結晶解析の結果，酸素耐性とCO耐性には正の相関があることを初めて明らかにして国際結晶学連合の学術誌に発表した．　NAD+還元ヒドロゲナーゼは，Ni-Fe活性部位自体が酸素による修飾を防御する分子機構を備えている．このNAD+還元ヒドロゲナーゼの酸化型結晶についてFT-IRによる構造解析を進展させた．（3）ラマン分光法による触媒活性定量法の開発：　昨年までの研究により，酵素と基質（気体水素）の反応は，主に酵素溶液相と気相との界面で起こっていることを見出していた．そこで，本年度は，酵素溶液をエアロゾルにして気相中に浮遊させて酵素触媒反応が測定可能であることを実証した．

(1) ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の temper in crystal structure: the end of the 2020 annual に sample modulation の た め の too 気 グ ロ ー ブ ボ ッ ク ス が fault し た が, コ ロ ナ disaster の influence で part adjustment of が 遅 れ, finished repair が の 2021 summer に し た. Japan atomic force open 発 research institutions, large intensity yoko accelerator facilities (J - PARC) に お け る temper in the crystallization of inflexion be 験 の ビ ー ム タ イ ム の schedule に crystallization modulation を close わ す こ と が で き ず, our の inflexion be 験 は be applied で き な か っ た. Party, last year saw a し た "acidification model enzyme crystal の Ni - Fe active site の tectonic が slanting ん で い る" に つ い て decomposition of high energy X-ray crystal parsing に よ る motors を progress さ せ た. To ら れ た X-ray structure analysis results は temper crystallization resolution result と も contradiction し な い こ と を confirm し, now paper 発 で in table prepared あ る. (2) ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ の acid element patience institutions, general is の established (intramolecular の water molecules cut interpret の service) : new rules の acid element patience enzyme で あ る, Citrobacter origin [NiFe] ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ に competition resistance against tonic で あ る a acidification carbon (CO) を さ せ て X-ray crystal structure parsing を be applied し た. The crystallization of analytical の results, acid tolerance と CO patience に は is の phase masato が あ る こ と を early め て Ming ら か に し て international crystallography commissure の academic ambition に 発 table し た. NAD + also yuan ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ は, Ni - Fe active site body が acid element に よ る modified を defense す る molecular institutions を prepare え て い る. <s:1> <s:1> NAD+ reduction ヒドロゲナ ゼ ゼ <s:1> acidified crystals に させた て てFT-IRによる structural analysis を progress させた. (3) ラ マ ン spectrometry に よ る catalytic activity of the quantitative method of open の 発 : yesterday in ま で の research に よ り, enzyme (気 body water element) の と matrix inverse 応 は, Lord に enzyme solution phase と 気 phase と の interface で up こ っ て い る こ と を shows し て い た. そ こ で は this year, the enzyme solution を エ ア ロ ゾ ル に し て 気 phase に planktonic さ せ て enzyme catalytic anti 応 が determination may で あ る こ と を card be し た.

项目成果

生物酵素・ヒドロゲナーゼにおける水素合成・活性化触媒反応機構の構造化学

生物酶和氢化酶中氢合成和活化催化反应机制的结构化学

• 发表时间: 2019
• 作者: T. Tamada;T. Hiromoto;K. Nishikawa;K. Kurihara;Y. Hirano;Y. Higuchi;Y. Higuchi;Y. Higuchi;樋口芳樹
• 通讯作者: 樋口芳樹

Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F株由来[NiFe]ヒドロゲナーゼの中性子回折実験

普通脱硫弧菌宫崎F株[NiFe]氢化酶的中子衍射实验

• 发表时间: 2019
• 作者: 玉田 太郎;廣本 武史;西川 幸志;井上 誠也;平野 優;樋口 芳樹
• 通讯作者: 樋口 芳樹

THEORETICAL ANALYSIS ON STRUCTURES OF RESTING OXIDIZED STATES OF [NIFE]HYDROGENASE

[NIFE]氢化酶静止氧化态结构的理论分析

• 发表时间: 2020
• 作者: K. Ishikawa;M. Shoji;Y. Hori;T. Hiromoto;Y. Higuchi;and Y. Shigeta
• 通讯作者: and Y. Shigeta

STRUCTURAL STUDIES ON [NiFe]-HYDROGENASES

[NiFe]-加氢酶的结构研究

• 发表时间: 2019
• 作者: T. Imanishi;H. Matsuura;H. Hasuike;T. Hiromoto;Y. Higuchi;Y. Higuchi
• 通讯作者: Y. Higuchi

NEW ASSAY METHOD FOR THE ENZYMES REACTING WITH GASEOUS SUBSTRATES BY RAMAN SPECTROSCOPY

拉曼光谱测定酶与气态底物反应的新方法

• 发表时间: 2020
• 作者: K. Nishikawa;Y. Kawahara;S. Inoue;T. Chuji;S. Nakashima;Y. Shigeta;K. Fukutani and Y. Higuchi
• 通讯作者: K. Fukutani and Y. Higuchi