Strukturelle Grundlagen und katalytische Funktion der Domänenbewegung der 5'-Nukleotidase

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Die Funktionsweise vieler Proteine hängt entscheidend von einer kontrollierten Änderung ihrer Raumstruktur ab. In Enzymen ist häufig eine Drehbewegung zweier Bereiche (Domänen) für die Katalyse notwendig. Trotz der fundamentalen Bedeutung dieser Bewegungen ist das Verhältnis zwischen Proteinstruktur, der Natur und Dynamik der Konformationsänderung und schließlich der Enzymkatalyse wenig verstanden. In dem vorliegenden Projekt werden diese Zusammenhänge anhand des Enzyms 5'-Nukleotidase (5'-NT) mit molekularbiologischen, biochemischen, spektroskopischen, kristallographischen und rechnergestützen Methoden untersucht. Die Struktur der 5'-NT wurde von uns in verschiedenen Kristallformen untersucht. Durch den Vergleich der verschiedenen Proteinkonformere zeigte sich, dass das Enzym eine neuartige und ungewöhnliche Art von Domänenrotation zeigt. In dem beantragten Projekt soll analysiert werden, inwieweit die Domänenrotation die katalytische Funktion des Enzyms ist beeinflusst. Weiterhin sollen die strukturellen Eigenschaften charakterisiert werden, die den Konformationswechsel ermöglichen und steuern. Dazu werden Varianten präpariert, die Mutationen in der Scharnierregion und der Domänengrenzfläche aufweisen sowie Mutanten, die in der geschlossenen Konformation getrappt sind. Durch spektroskopische Untersuchungen (NMR, Fluoreszenz und EPR) sollen das Gleichgewicht und möglichst die Geschwindigkeitskonstante der Konformationsänderung bestimmt werden. So soll u.a. geklärt werden, ob die Domänenbewegung auch in Abwesenheit des Substrates (oder von Inhibitoren) stattfindet oder ob die Schließbewegung erst durch die Substratbindung induziert wird.