Establishment of a functional screening method for disease susceptible variants in arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy.

建立致心律失常性右心室发育不良/心肌病疾病易感变异的功能筛查方法。

• 批准号: 18K15844
• 负责人: 和田 悠子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Shiga University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-01 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K15844/
• 关键词: 不整脈; 心筋症; 遺伝子; 多型; 遺伝子多型; デスモゾーム; 不整脈源性右室心筋症; 遺伝子変異

目的①-[1] マウスDsg2によって維持される細胞接着性を検証する、[2] Dsg2多型D494A発現細胞では細胞間分布密度が減少している、[3] Dsg2安定発現細胞を用いた、細胞間接着密度と強度の定量評価。（目的①[1]~[3]の成果）Dsg2非発現細胞（非ヒト細胞）に異種強制発現させた場合、変異型デスモグレイン2(以下Dsg2)を介する細胞間接着の緊密性が乏しいことを示した。目的①-[3]について、デスモグレイン2蛋白の安定発現細胞株の取得に時間を要している。従来のトランスフェクション-選択抗生剤を用いる手法ではチャイニーズハムスター卵巣細胞での安定発現は得られなかったため、ウイルス感染を介した安定発現株取得を目指し、学内の遺伝子組み換え実験の申請手続きを行った（施設内認定に2ヶ月を要した）。目的②[4] Fc-Dsg2分子を用いたDsg2の細胞間接着機能スクリーニング。（目的②の成果）未着手である。目的③[5] Dsg2と相互作用しうる候補蛋白の同定と機能解析。（目的③[5]の成果）Dsg2と相補的に結合しうる未知の蛋白の検出は、マウス心筋サンプル内に存在すると想定し、大腸菌体内で作成したGST融合型Dsg2をbait(餌)にしてpull downし、TOF-MSを複数回行ったが、質量分析過程でノイズ値が高く、候補蛋白の絞り込みは出来なかった。十分量のマウス心筋サンプルを用いたにも関わらず、Dsg2と相補的に結合しうる未知の蛋白が検出されない原因として、①Dsg2が何ものとも協同していない、②協同しているが、結合の達成に糖鎖が関与しているために、大腸菌体内で作成したGST融合型Dsg2とは結合できない、可能性を考えた。②は、ヒト由来培養細胞を用いて分泌型蛋白を回収し、糖鎖を保存して蛋白を大量精製することで達成可能性がある。

Objective: ① To evaluate the cell adhesion of Dsg2,[2] Dsg2 polytype D494A developing cells,[3] Dsg2 stable developing cells, and quantitative evaluation of cell adhesion density and strength. The results of [1]-[3] showed that the adhesion between cells was poor when heterogenous stress occurred in Dsg2 non-developing cells (non-developing cells) and when heterogenous stress occurred in Dsg2 (hereinafter referred to as Dsg2). Objective: 1-[3] To study the time of obtaining stable cell lines for protein 2 development. In the future, the method of selecting antibiotics will be used to obtain stable development of egg cells, and the method of obtaining stable development of egg cells will be used to obtain stable development of egg cells, and the method of selecting antibiotics will be used to obtain stable development of egg cells. Objective 2 [4] Fc-Dsg2 molecule can be used to detect Dsg2 cell adhesion function. (2) The goal is not to start. Objective To elucidate the identity and function of Dsg2 interacting candidate proteins. (Objective 3 [5]) Dsg2 and complementary binding, unknown protein detection, its existence in the core protein, determination of GST-fusion Dsg2 in Escherichia coli, TOF-MS, multiple loop detection, mass analysis process, candidate protein detection. The reason why Dsg2 is detected is unknown. The reason why Dsg2 is detected is detected is unknown. The reason why Dsg2 is detected is unknown. The reason why Dsg2 is detected is detected is unknown. The reason why Dsg2 is detected is unknown. The reason why Dsg2 is detected is detected is unknown. The reason why Dsg2 is detected is unknown. The reason why Dsg2 is detected. The reason why Dsg2 is detected is detected is unknown. The reason 2. It is possible to purify large quantities of secreted proteins by using cultured cells.