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ミトコンドリアに輸送される新奇核コードRNAの網羅的探索

全面寻找转运至线粒体的新型核编码RNA

基本信息

批准号：
22K15108
负责人：
篠田沙緒里
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Kyoto Sangyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究はまずミトコンドリアRNAの新規ラベル化手法の確立から, ミトコンドリア内に存在する核コードRNAの同定を目指した. ミトコンドリア内のRNAのみを標識するために, ミトコンドリア局在型APEX2を発現させた酵母から単離したミトコンドリアを用いてRNAをビオチンラベルすることに成功した. 次に, ビオチン化RNAをアフィニティビーズで精製し, RNA-seq解析に供した. その結果, ほとんどのミトコンドリアDNA (mtDNA) にコードされたRNAが，有意にビオチン化濃縮されたRNAとして再現性良く同定された. 一方で, サイトゾルに多量に存在するRNAは効率よく濃縮されなかったことから, この方法がミトコンドリア内のRNAの検出法として有効であることが示された. さらにmtDNA由来のRNAと同程度に高効率で濃縮された核ゲノム由来のRNAが複数種同定され, これらのRNAがミトコンドリア内に存在する可能性が示された. しかし, 一部のサイトゾル成分に含まれるRNAは一定数ビオチン化ラベルしてしまうことが明らかとなったことから, 得られた候補遺伝子の再検証を行う必要があった. そこで, これらの候補遺伝子がミトコンドリア内に存在するかどうかを蛍光in situ ハイブリダイゼーション (FISH) を用いたRNAの細胞内局在を確認した。通常のFISHでは発現量の低い候補遺伝子の解析が困難だったため, single molecule FISHを導入した. その結果RNAseqで得られた候補遺伝子の一部はミトコンドリアへ局在することを明らかにした. 以上の結果から, 新規ラベル化手法を確立し, ミトコンドリアへ輸送されるRNAの遺伝子候補群の絞り込みに成功し, RNAの細胞内局在から確かにこれらのRNAがミトコンドリアに存在することを証明した.

This study aims to establish a new method for the identification of nuclear DNA in the presence of DNA. The expression of RNA in the genome was successfully detected by APEX2. Next, the RNA sequence was refined, RNA-seq analysis was performed. As a result, the DNA (mtDNA) was isolated and the RNA was intentionally concentrated. In one way, there is a large amount of RNA in the body, and the method of RNA extraction in the body is shown. The high efficiency of mtDNA DNA RNA in the same level indicates the possibility of multiple species of mtDNA RNA in the same level. A part of the RNA component contains a certain number of RNA, which is necessary for the identification of candidate genes. The candidate RNA is present in the cell and is confirmed by FISH. Usually FISH is difficult to detect and analyze low candidate molecules, single molecule FISH is introduced. The results of RNAseq are as follows: 1. As a result, the new method of RNA isolation was established, and the RNA gene candidate group was successfully isolated from the RNA gene carrier.