ミトコンドリアに輸送される新奇核コードRNAの網羅的探索

本研究はまずミトコンドリアRNAの新規ラベル化手法の確立から, ミトコンドリア内に存在する核コードRNAの同定を目指した. ミトコンドリア内のRNAのみを標識するために, ミトコンドリア局在型APEX2を発現させた酵母から単離したミトコンドリアを用いてRNAをビオチンラベルすることに成功した. 次に, ビオチン化RNAをアフィニティビーズで精製し, RNA-seq解析に供した. その結果, ほとんどのミトコンドリアDNA (mtDNA) にコードされたRNAが，有意にビオチン化濃縮されたRNAとして再現性良く同定された. 一方で, サイトゾルに多量に存在するRNAは効率よく濃縮されなかったことから, この方法がミトコンドリア内のRNAの検出法として有効であることが示された. さらにmtDNA由来のRNAと同程度に高効率で濃縮された核ゲノム由来のRNAが複数種同定され, これらのRNAがミトコンドリア内に存在する可能性が示された. しかし, 一部のサイトゾル成分に含まれるRNAは一定数ビオチン化ラベルしてしまうことが明らかとなったことから, 得られた候補遺伝子の再検証を行う必要があった. そこで, これらの候補遺伝子がミトコンドリア内に存在するかどうかを蛍光in situ ハイブリダイゼーション (FISH) を用いたRNAの細胞内局在を確認した。通常のFISHでは発現量の低い候補遺伝子の解析が困難だったため, single molecule FISHを導入した. その結果RNAseqで得られた候補遺伝子の一部はミトコンドリアへ局在することを明らかにした. 以上の結果から, 新規ラベル化手法を確立し, ミトコンドリアへ輸送されるRNAの遺伝子候補群の絞り込みに成功し, RNAの細胞内局在から確かにこれらのRNAがミトコンドリアに存在することを証明した.

本研究はまずミトコンドリアRNAの新規ラベル化手法の確立から, ミトコンドリア内に存在する核コードRNAの同定を目指した. ミトコンドリア内のRNAのみを標識するために, ミトコンドリア局在型APEX2を発現させた酵母から単離したミトコンドリアを用いてRNAをビオチンラベルすることに成功した. 次に, ビオチン化RNAをアフィニティビーズで精製し, RNA-seq解析に供した. その結果, ほとんどのミトコンドリアDNA (mtDNA) にコードされたRNAが，有意にビオチン化濃縮されたRNAとして再現性良く同定された. 一方で, サイトゾルに多量に存在するRNAは効率よく濃縮されなかったことから, この方法がミトコンドリア内のRNAの検出法として有効であることが示された. さらにmtDNA由来のRNAと同程度に高効率で濃縮された核ゲノム由来のRNAが複数種同定され, これらのRNAがミトコンドリア内に存在する可能性が示された. しかし, 一部のサイトゾル成分に含まれるRNAは一定数ビオチン化ラベルしてしまうことが明らかとなったことから, 得られた候補遺伝子の再検証を行う必要があった. そこで, これらの候補遺伝子がミトコンドリア内に存在するかどうかを蛍光in situ ハイブリダイゼーション (FISH) を用いたRNAの細胞内局在を確認した。通常のFISHでは発現量の低い候補遺伝子の解析が困難だったため, single molecule FISHを導入した. その結果RNAseqで得られた候補遺伝子の一部はミトコンドリアへ局在することを明らかにした. 以上の結果から, 新規ラベル化手法を確立し, ミトコンドリアへ輸送されるRNAの遺伝子候補群の絞り込みに成功し, RNAの細胞内局在から確かにこれらのRNAがミトコンドリアに存在することを証明した.