蚊組織におけるフラビウイルスの糖鎖修飾部位に対する選択メカニズムの解明

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本研究の目標は蚊体内で遺伝子学的に多様な状態（Quasispecies）で存在するフラビウイルスが、エンベロープの糖鎖修飾部位について、どのようなメカニズムで特定の遺伝子型が選択されていくか明らかにすることである。そのため、2022年度は1. デングウイルスおよびジカウイルスの感染性クローンの確立と2. 蚊の組織特異的細胞株樹立のための不死化プラスミドの構築を目指した。1. デングウイルスおよびジカウイルスの感染性クローンの確立前段階として、ウイルスと細胞の結合を評価するため、糖鎖修飾部位に変異やFLAGタグを加えたジカウイルスのVirus-like particles（VLPs）を構築した。また、Circular Polymerase Extension Reaction（CPER）法を用いた感染性クローン確立のため、逆転写PCRによる断片化したジカウイルス遺伝子の増幅とリンカー配列の増幅を行った。2. 蚊の組織特異的細胞株樹立のための不死化プラスミドの構築CMV、CAG、IE1、OpIE2プロモーターおよびGFP遺伝子を用い、蚊由来株化細胞（C6/36）でのプロモーター活性を評価した。またT2A配列およびネオマイシン耐性遺伝子を用い、G418存在下での恒常発現系の構築を目指した。その結果、CMVプロモーターとBGH pAの組み合わせで、400μg/mlのG418存在下、GFP遺伝子の恒常発現系が構築された。また前述のプラスミドを基にGFP遺伝子をヒト癌原遺伝子であるcMYCに置き換えた不死化プラスミドを構築した。