炎症性腸疾患における生物学的製剤の腸管組織中濃度の測定法開発

开发一种测量炎症性肠病生物制剂肠道组织浓度的方法

• 批准号: 22K16007
• 负责人: 井原 聡三郎
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2027-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16007/
• 关键词: 炎症性腸疾患; 生物学的製剤; 薬物濃度モニタリング

炎症性腸疾患（IBD）の治療薬として生物学的製剤が多数承認されている。各製剤を適正に使用する上で、血中濃度モニタリングのみならず腸管や糞便などIBDの炎症と深く関係する部位の薬物動態の把握が重要となる。しかし、従来のELISA法では腸や糞便中の微量な生物学的製剤の検出がしばしば困難となる。そこで本研究は、LC-MS/MSによる質量分析法を基に感度や精度を上げる技術的工夫を加え、組織中の生物学的製剤の濃度測定法を確立する。さらに、実際に本測定法を用いて、製剤治療中IBD患者の大腸組織中の製剤濃度とIBD治療効果との関連を評価する。本年度は、LC-MS/MSによる質量分析法を用いた腸管組織や糞便中の生物学的製剤の濃度測定を確立するための検証実験を行った。製剤濃度の標準曲線を作成するため、未治療マウスの腸管組織および糞便から蛋白を抽出し、その蛋白抽出液に濃度既知の生物学的製剤（IFX、VDZ、UST）を添加した。さらにトリプシンによる蛋白分解を経てLC-MS/MSにてペプチド分析を行い、各製剤の特異的ペプチドを同定し定量した。特に、腸管組織および糞便中からの蛋白抽出法の検討を行った。ホモジナイザー（Mini-beadbeater-96, BioSpec）と界面活性剤を用いた物理的破砕/溶解による蛋白抽出を検討した。4種類の界面活性剤（Guanidine hydrochloride; GuHCl，triton X-100, Sodium dodecyl sulfate, Deoxycholate）各々について蛋白抽出効率を検討した。現時点の検討では6M GuHClと1% triton X-100の効率が良いことが再現性を持って確認された。本研究の課題である免疫沈降法の併用において、界面活性剤による蛋白質変性が免疫沈降法の回収効率を下げる可能性がある。変性作用の強いGuHClを用いた後に透析法で変性解除するか、非変性のtriton X-100を用いるかなどを本研究で検討し、最適な蛋白抽出法を現在検討中である。

The treatment of inflammatory bowel disease (IBD) is based on biological research and development. Each preparation is suitable for use and the concentration in the blood is the same as that of the intestinal tube and feces. It is important to understand the inflammation of IBD due to its deep relationship and the dynamics of the patient's body parts. The ELISA method used in this study is difficult for the biological preparation of trace amounts in feces. In this study, the LC-MS/MS mass analysis method was based on the sensitivity and precision of the technology, and the biological preparation and concentration measurement method in the tissue was established. This determination method is used to evaluate the correlation between the concentration of the preparation in the large intestine tissue of patients with IBD and the therapeutic effect of IBD during treatment with the preparation. This year, the LC-MS/MS mass spectrometry method was used to determine the concentration of biological preparations in intestinal tissue and feces, and the certification of the laboratory was established. The standard curve of the concentration of the preparation was prepared, the untreated intestinal tissue was extracted, and the protein was extracted from the feces. The protein extract was prepared from a biological preparation (IFX, VDZ, UST) with a known concentration.さらにトリプシンによる Protein decomposition LC-MS/MS にてペプチド analysis を行い, each preparation のspecific ペプチドを Same determination しした. The special method is to extract protein from the intestinal tissue and feces. Mini-beadbeater-96, BioSpec uses an interface active agent to physically break/dissolve proteins and extract them. Four types of interface active agents (Guanidine hydrochloride; GuHCl, triton X-100, Sodium dodecyl sulfate, Deoxycholate) each have different protein extraction efficiency. The current point is that the efficiency of 6M GuHCl and 1% triton X-100 is good and the reproducibility is confirmed. The subject of this study is the possibility of lowering the recovery efficiency of the immunoprecipitation method due to the combined use of the immunoprecipitation method and the protein condensation properties of the interface activity. The anti-inflammatory effect of GuHCl is strong, and the dialysis method can be used to remove the anti-inflammatory effect. X-100 is used in this study and the optimal protein extraction method is currently being studied.