Cross-talk and extensive rewiring of CRISPR-Cas systems with the cellular regulatory machinery in cyanobacteria

CRISPR-Cas系统与蓝藻细胞调节机制的串扰和广泛重连

基本信息

项目摘要

With this proposal we aim at analyzing the CRISPR-Cas systems in cyanobacteria with a focus on their interaction with the regulatory machinery of the host. As model organism we have chosen the unicellular strain Synechocystis sp. PCC 6803. This strain carries three CRISPR-Cas systems. Two of them were classified as subtype I-D and subtype III-D. The third constitutes a III-B variant (III-Bv), characterized by a Cmr6_Cmr1 fusion, a replaced Cmr5 protein, the possible involvement of a peptidase and the lack of an associated Cas6 maturation endoribonuclease. Bioinformatic predictions suggest similar variant systems to exist also in other prokaryotes. Instead of Cas6 we found that the host-encoded endoribonuclease E was recruited as the major maturation enzyme, which raises questions about the involved molecular and evolutionary mechanisms. It directly suggests that there are additional host- and CRISPR-encoded factors that need to be identified, e.g., in loading mature crRNAs into the surveillance complexes, in performing the 3’ end maturation of crRNAs, in modulating RNase specificity as well as the type of nucleic acid targeted by the CRISPR-Cas complexes. We will address these questions using pull-down assays, the characterization of deletions for respective candidate genes in interference assays and by molecular analyses, the elucidation of an RNase E-CRISPR-repeat-RNA cocrystal structure and determination of the entire CRISPR3 complex structure. However, the possible interplay between CRISPR-associated RNases and the processes governing the maturation and stability of transcripts appears more complex than previously anticipated also with regard to the Cas6-dependent other two CRISPR-Cas systems. Therefore, we will also address the possible impact on the host transcriptome as well as redox control through the host-encoded RpaB-NblS two-component system. In both cases, the involvement of additional enzymes and the possible consequences for the post-transcriptional regulation of gene expression will be followed. The project work will be complemented by the metagenomic analysis of cyanobacterial mass developments to understand the evolving architecture of the studied types of CRISPR-Cas systems and their integration into and interaction with the cellular regulatory apparatus.
通过这项提议,我们的目标是分析蓝藻中的CRISPR-Cas系统,重点是它们与宿主调控机制的相互作用。作为模式生物,我们选择了单细胞菌株集胞藻属PCC 6803。该菌株携带三个CRISPR-Cas系统。其中2例为I-D亚型和III-D亚型。第三种构成了III-B变体(III-Bv),其特征在于Cmr6_Cmr1融合,取代的Cmr 5蛋白,可能涉及肽酶和缺乏相关的Cas 6成熟核糖核酸内切酶。生物信息学的预测表明类似的变异系统也存在于其他原核生物中。我们发现宿主编码的核糖核酸内切酶E被招募为主要的成熟酶,而不是Cas 6,这引发了有关所涉及的分子和进化机制的问题。它直接表明,还有其他宿主和CRISPR编码的因子需要鉴定,例如,在将成熟crRNA加载到监视复合物中、在进行crRNA的3'末端成熟、在调节RNA酶特异性以及由CRISPR-Cas复合物靶向的核酸类型中。我们将使用下拉测定来解决这些问题,在干扰测定中表征各个候选基因的缺失,并通过分子分析,阐明RNase E-CRISPR-repeat-RNA共晶体结构并确定整个CRISPR 3复合物结构。然而,CRISPR相关的RNA酶与控制转录物成熟和稳定性的过程之间可能的相互作用似乎比先前关于Cas 6依赖的其他两个CRISPR-Cas系统的预期更复杂。因此,我们还将通过宿主编码的RpaB-NblS双组分系统解决对宿主转录组的可能影响以及氧化还原控制。在这两种情况下,参与额外的酶和基因表达的转录后调控的可能后果将被跟踪。该项目工作将通过对蓝藻质量发展的宏基因组分析来补充,以了解所研究类型的CRISPR-Cas系统的演变结构及其与细胞调控装置的整合和相互作用。

项目成果

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