ヒトiPS細胞由来腎臓オルガノイドを用いたLMX1B変異に伴う腎症の病態解明

使用人 iPS 细胞衍生的肾类器官阐明与 LMX1B 突变相关的肾病病理学

基本信息

批准号：
22K16246
负责人：
田中悦子
金额：
$ 2.91万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16246/
关键词：
LMX1B 腎臓オルガノイド iPS細胞ヒトポドサイト

项目摘要

LMX1B遺伝子は、腎臓で血液から尿を濾過するろ過装置である糸球体の発生や、糸球体の中で濾過膜を形成する上皮細胞とスリット膜の形態および機能維持に関与することが知られている。そして、LMX1B遺伝子異常は蛋白尿および腎機能障害を来すLMX1B遺伝子関連腎症の原因であることがわかっているが、その病態は明らかになっていない。マウスのモデルではヒトの病態を再現できておらず、ヒト特有の病態モデル作製が期待されている。近年、ヒトiPS細胞から腎臓オルガノイドの分化誘導法が確立され(Cell Stem Cell, 2014;2;14:53-67)、ヒト細胞由来の糸球体上皮細胞およびスリット膜の構造をin vitroで再現できるようになった。そこで我々は、LMX1B変異を導入したヒトiPS細胞から腎臓オルガノイドを誘導し、ヒトLMX1B関連腎症の病態モデルを作製と病態解析を試みている。まず、健常者由来ヒトiPS細胞のLMX1B遺伝子にCRISPR/Cas9システムを用いて、ゲノム編集を行った。iPS細胞の培養とgRNAのデザインを行い、エレクトロポレーション法でゲノム編集した。エレクトロポレーション後のバルク細胞集団から抽出したゲノムDNAのPCRおよび制限酵素切断、シークエンス解析を行い、ゲノム編集が成功したことを確認した。限界希釈法によるサブクローニングを行い、ノックアウト株と正常株をそれぞれ3つずつ樹立できた。しかし、ヘテロ変異株が得られず、再度、同様の方法でゲノム編集を行った。２回目のエレクトロポレーション後のバルク細胞に変異導入が成功した細胞が含まれていることが確認できており、サブクローニングを開始する。今後、樹立した株ごとに腎臓オルガノイドへの分化能を確認し、LMX1B腎症の病態モデルとして解析を行う予定である。

已知LMX1B基因参与肾小球的发展，Glomerulus是一种过滤肾脏中尿液的过滤装置，以及维持上皮细胞和裂隙膜的形态和功能，形成肾小球中的滤膜。众所周知，LMX1B基因异常是LMX1B基因相关的肾病的原因，引起蛋白尿和肾功能障碍，但尚未揭示该疾病的病理学。小鼠模型无法复制人类病理学，预计人类特异性病理学模型的创建是一种病理。近年来，已经建立了诱导肾脏器官与人IPS细胞分化的方法（Cell Stem Cell，2014; 2; 14：53-67），从而使人类细胞的结构可以在体外重现。因此，我们试图诱导与LMX1B突变引入的人IPS细胞中的肾脏器官，并为人LMX1B相关的肾病创建病理模型并分析病理条件。首先，使用CRISPR/CAS9系统从健康个体衍生的人IPS细胞的LMX1B基因进行了基因组编辑。培养IPS细胞并设计GRNA，并使用电穿孔进行基因组编辑。 PCR，限制酶裂解和对电穿孔后从散装细胞种群中提取的基因组DNA进行测序分析，以确认成功的基因组编辑。使用极限稀释法进行了亚克隆，并建立了三个敲除菌株和正常菌株。但是，未获得异源菌株，并以相同的方式再次进行基因组编辑。已经证实，第二次电穿孔后的散装细胞包含成功突变的细胞，并开始了亚克隆。将来，我们计划确认每个已建立的菌株在肾脏器官中的分化能力，并将其分析为LMX1B肾病的病理模型。