ヒトiPS細胞由来腎臓オルガノイドを用いたLMX1B変異に伴う腎症の病態解明

使用人 iPS 细胞衍生的肾类器官阐明与 LMX1B 突变相关的肾病病理学

• 批准号: 22K16246
• 负责人: 田中 悦子
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16246/
• 关键词: LMX1B; 腎臓; オルガノイド; iPS細胞; ヒト; ポドサイト

LMX1B遺伝子は、腎臓で血液から尿を濾過するろ過装置である糸球体の発生や、糸球体の中で濾過膜を形成する上皮細胞とスリット膜の形態および機能維持に関与することが知られている。そして、LMX1B遺伝子異常は蛋白尿および腎機能障害を来すLMX1B遺伝子関連腎症の原因であることがわかっているが、その病態は明らかになっていない。マウスのモデルではヒトの病態を再現できておらず、ヒト特有の病態モデル作製が期待されている。近年、ヒトiPS細胞から腎臓オルガノイドの分化誘導法が確立され(Cell Stem Cell, 2014;2;14:53-67)、ヒト細胞由来の糸球体上皮細胞およびスリット膜の構造をin vitroで再現できるようになった。そこで我々は、LMX1B変異を導入したヒトiPS細胞から腎臓オルガノイドを誘導し、ヒトLMX1B関連腎症の病態モデルを作製と病態解析を試みている。まず、健常者由来ヒトiPS細胞のLMX1B遺伝子にCRISPR/Cas9システムを用いて、ゲノム編集を行った。iPS細胞の培養とgRNAのデザインを行い、エレクトロポレーション法でゲノム編集した。エレクトロポレーション後のバルク細胞集団から抽出したゲノムDNAのPCRおよび制限酵素切断、シークエンス解析を行い、ゲノム編集が成功したことを確認した。限界希釈法によるサブクローニングを行い、ノックアウト株と正常株をそれぞれ3つずつ樹立できた。しかし、ヘテロ変異株が得られず、再度、同様の方法でゲノム編集を行った。２回目のエレクトロポレーション後のバルク細胞に変異導入が成功した細胞が含まれていることが確認できており、サブクローニングを開始する。今後、樹立した株ごとに腎臓オルガノイドへの分化能を確認し、LMX1B腎症の病態モデルとして解析を行う予定である。

Perforatien で LMX1B heritage 伝 は, kidney blood か ら urine を filtration す る ろ a device で あ る si sphere の 発 や, si sphere の を で filtration membrane forming す る epithelial cells と ス リ ッ ト membrane の form お よ び function maintain に masato and す る こ と が know ら れ て い る. そ し て, LMX1B heritage 伝 child abnormal は proteinuria お よ び renal function handicap of を to す LMX1B posthumous son 伝 masato の even kidney disease causes で あ る こ と が わ か っ て い る が, そ の pathological は Ming ら か に な っ て い な い. マ ウ ス の モ デ ル で は ヒ ト の pathological を reappearance で き て お ら ず, ヒ ト の special pathological モ デ が expect the ル cropping さ れ て い る. In recent years, ヒ ト iPS cells か ら renal viscera オ ル ガ ノ イ ド の differentiation candidated が establish さ れ (Cell Stem Cell, 2014; 2; 14:53-67), ヒ ト Cell origin の si sphere epithelial cells お よ び ス リ ッ を の ト membrane structure in vitro で reappearance で き る よ う に な っ た. そ こ で I 々 は, LMX1B - different を import し た ヒ ト iPS cells か ら renal viscera オ ル ガ ノ イ ド を induced し, ヒ ト LMX1B masato の even kidney disease pathological モ デ ル を cropping と pathological parsing を try み て い る. ま ず, health often origin ヒ ト iPS cells の LMX1B posthumous son 伝 に CRISPR/Cas9 シ ス テ ム を with い て, ゲ ノ line compiling を ム っ た. The iPS cells are <s:1> cultured with とgRNA デザ デザ デザ <s:1> を を and エレ <s:1> トロポレ ショ ショ ショ でゲノム are collected by でゲノム and た. エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン after の バ ル ク cells sets 団 か ら spare し た ゲ ノ ム の DNA PCR お よ び enzyme cut the limitations, シ ー ク エ ン ス parsing を い, ゲ ノ compiling が ム successful し た こ と を confirm し た. Margin when 釈 method に よ る サ ブ ク ロ ー ニ ン グ を い, ノ ッ ク ア ウ ト seedlings を と normal そ れ ぞ れ 3 つ ず つ set で き た. The った でゲノム, ヘテロ variant of が, られず, again, the same <s:1> method でゲノム compilation を line った. 2 pa2 の エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン after の バ ル に ク cells - different import が successful し が た cells contain ま れ て い る こ と が confirm で き て お り, サ ブ ク ロ ー ニ ン グ を began す る. In the future, set up し た strains ご と に renal viscera オ ル ガ ノ イ ド へ の differentiation can を confirm し, LMX1B kidney disease の pathological モ デ ル と し て parsing line を う designated で あ る.