ヒトiPS細胞由来腎臓オルガノイドを用いたLMX1B変異に伴う腎症の病態解明

使用人 iPS 细胞衍生的肾类器官阐明与 LMX1B 突变相关的肾病病理学

• 批准号: 22K16246
• 负责人: 田中 悦子
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16246/
• 关键词: LMX1B; 腎臓; オルガノイド; iPS細胞; ヒト; ポドサイト

LMX1B遺伝子は、腎臓で血液から尿を濾過するろ過装置である糸球体の発生や、糸球体の中で濾過膜を形成する上皮細胞とスリット膜の形態および機能維持に関与することが知られている。そして、LMX1B遺伝子異常は蛋白尿および腎機能障害を来すLMX1B遺伝子関連腎症の原因であることがわかっているが、その病態は明らかになっていない。マウスのモデルではヒトの病態を再現できておらず、ヒト特有の病態モデル作製が期待されている。近年、ヒトiPS細胞から腎臓オルガノイドの分化誘導法が確立され(Cell Stem Cell, 2014;2;14:53-67)、ヒト細胞由来の糸球体上皮細胞およびスリット膜の構造をin vitroで再現できるようになった。そこで我々は、LMX1B変異を導入したヒトiPS細胞から腎臓オルガノイドを誘導し、ヒトLMX1B関連腎症の病態モデルを作製と病態解析を試みている。まず、健常者由来ヒトiPS細胞のLMX1B遺伝子にCRISPR/Cas9システムを用いて、ゲノム編集を行った。iPS細胞の培養とgRNAのデザインを行い、エレクトロポレーション法でゲノム編集した。エレクトロポレーション後のバルク細胞集団から抽出したゲノムDNAのPCRおよび制限酵素切断、シークエンス解析を行い、ゲノム編集が成功したことを確認した。限界希釈法によるサブクローニングを行い、ノックアウト株と正常株をそれぞれ3つずつ樹立できた。しかし、ヘテロ変異株が得られず、再度、同様の方法でゲノム編集を行った。２回目のエレクトロポレーション後のバルク細胞に変異導入が成功した細胞が含まれていることが確認できており、サブクローニングを開始する。今後、樹立した株ごとに腎臓オルガノイドへの分化能を確認し、LMX1B腎症の病態モデルとして解析を行う予定である。

LMX-1B gene transfer, kidney, blood, urine filtration, filtration, epithelial cell development, filtration membrane formation, membrane morphology and function maintenance LMX-1B gene abnormalities, proteinuria and renal dysfunction are the causes of kidney disease associated with LMX-1B gene. It's not like we're going to get sick again, or like we're going to get sick again. In recent years, the differentiation induction method for iPS cells has been established (Cell Stem Cell, 2014;2;14:53-67), and the structure of spherical epithelial cells derived from iPS cells has been reproduced in vitro. In addition, LMX-1B was introduced into iPS cells to induce kidney disease, and LMX-1B was associated with kidney disease and pathological analysis. The CRISPR/Cas9 gene system was developed by using the LMX1B gene from iPS cells. Culture of iPS cells and gRNA gene expression in vitro and in vitro DNA PCR and restriction enzyme analysis were performed, and DNA editing was successfully performed. The limit of the law is to set up a plant in the middle of the line, to set up a plant in the middle of the line, to set up a plant in the normal line In addition to the above, we can also use the same method to compile and implement the project. 2. The cells were successfully introduced into the cells after the first round of the study. The cells were confirmed to have been successfully introduced. In the future, the differentiation ability of LMX 1B kidney disease will be confirmed and the pathological analysis of LMX1B kidney disease will be determined.