In vitro cerebral infarction model using assembloid culture system

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初年度は大脳オルガノイド及び内側神経節隆起オルガノイドの誘導を行い、誘導方法としては安定して作出できるようになった。両者の分化については、定量的RT-PCRでのマーカー遺伝子の発現で確認されている。現在、iPS細胞標準株３ラインでの誘導の大脳オルガノイドの検討をおこない、分化指向性もしくは継代状態による影響で効率的な分化は２ラインにとどまっている。このため今後のRNAseqでの検討に際して、検討に必要なライン数を確保できていないため、大脳オルガノイドに効率よく分化しうる他のiPS細胞標準株もしくは、維持状態の良好なiPS細胞標準株の確保が必須であると考えられた。並行して低酸素培養キットを用いた試験管内虚血負荷モデルの検討を進めている。同キットを使用した場合に、培養条件下の大脳オルガノイドに対して虚血負荷に類似した細胞毒性の出現を確認できるかをまずに確認予定であるが、すでにキットの導入を終え、実際に培養に用いるiPS細胞の拡大培養及び大脳オルガノイドの調整準備を進めている。準備出来次第、まずは１－６時間の負荷で細胞毒性が確認しうるかを免疫染色法で評価し、虚血負荷の条件の設定を考えている。実験系を確立するにあたり、低酸素培養に用いる培地の扱いや調製についてのプロトコルの作成を具体的に進めている。特に、調製の際に培地内に酸素が多く持ち込まれると、溶存酸素(DO)が数時間の低酸素培養の間に想定される平衡状態に達しない可能性が考えられ、その影響を十分に考慮する必要性が判明し、この点に関しての手技上の工夫や評価系の追加を検討している。