In vitro cerebral infarction model using assembloid culture system

使用Assembloid培养系统建立体外脑梗死模型

• 批准号: 22K16685
• 负责人: 馬塲 庸平
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16685/
• 关键词: iPS細胞; 虚血耐性; 脳梗塞; 大脳オルガノイド

初年度は大脳オルガノイド及び内側神経節隆起オルガノイドの誘導を行い、誘導方法としては安定して作出できるようになった。両者の分化については、定量的RT-PCRでのマーカー遺伝子の発現で確認されている。現在、iPS細胞標準株３ラインでの誘導の大脳オルガノイドの検討をおこない、分化指向性もしくは継代状態による影響で効率的な分化は２ラインにとどまっている。このため今後のRNAseqでの検討に際して、検討に必要なライン数を確保できていないため、大脳オルガノイドに効率よく分化しうる他のiPS細胞標準株もしくは、維持状態の良好なiPS細胞標準株の確保が必須であると考えられた。並行して低酸素培養キットを用いた試験管内虚血負荷モデルの検討を進めている。同キットを使用した場合に、培養条件下の大脳オルガノイドに対して虚血負荷に類似した細胞毒性の出現を確認できるかをまずに確認予定であるが、すでにキットの導入を終え、実際に培養に用いるiPS細胞の拡大培養及び大脳オルガノイドの調整準備を進めている。準備出来次第、まずは１－６時間の負荷で細胞毒性が確認しうるかを免疫染色法で評価し、虚血負荷の条件の設定を考えている。実験系を確立するにあたり、低酸素培養に用いる培地の扱いや調製についてのプロトコルの作成を具体的に進めている。特に、調製の際に培地内に酸素が多く持ち込まれると、溶存酸素(DO)が数時間の低酸素培養の間に想定される平衡状態に達しない可能性が考えられ、その影響を十分に考慮する必要性が判明し、この点に関しての手技上の工夫や評価系の追加を検討している。

In the early years, the induction of large and medium-sized nerve segments was carried out, and the induction method was carried out. Quantitative RT-PCR was performed to confirm the presence of DNA. Now, iPS cell standard strain 3 is induced by a large number of factors, such as differentiation orientation, generation status, and efficiency. The number of cells necessary for the future RNAseq test is required to ensure that the iPS cell standard strain is maintained in good condition. In parallel, the low acid culture medium was used to test the blood load in the tube. In the same way, when used in culture conditions, large cell culture conditions are required for identification of the presence of similar cytotoxicity due to insufficient blood load. In addition, the introduction of small cell culture conditions is required for identification of the presence of similar cytotoxicity. In the case of actual culture, iPS cells are prepared for large cell culture and large cell culture conditions. Preparation order, loading time 1-6 days, cytotoxicity confirmation, immunostaining, evaluation, blood deficiency loading condition setting In order to establish a system of low acid nutrient culture, the medium and high acid nutrient culture medium, the medium and high acid nutrient culture medium and high acid culture medium and high acid nutrient culture medium and high acid culture medium In particular, during modulation, the amount of acid in the culture medium should be kept constant, the amount of dissolved acid (DO) should be kept constant, the equilibrium state should be determined, the possibility of reaching equilibrium should be considered, the influence of DO should be considered, the necessity should be determined, the relevant technical time should be spent, and the additional evaluation system should be discussed.