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大腸菌の挿入因子IS1及びIS3の転移とその調節機構に関する研究

大肠杆菌插入因子IS1和IS3转座及其调控机制研究

基本信息

批准号：
09780624
负责人：
関根靖彦
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

(1) IS1、IS3の転移に関与する宿主因子の検索;IS1、IS3において転移に影響を与える因子を検索、同定するために、各種の大腸菌変異株(ヒストン様タンパク質[IHF,H-NS,HU,FIS,StpA,Dps,Hfq]、組換え関連タンパク質[RecQ,RuvCJ)におけるISの転移能や環状IS分子の生成の有無を調べたところ、H-NS欠損株ではIS1の転移が起こらないことがわかり、H-NSがIS1転移に必須な宿主因子であることがわかった。(2) IS1、IS3のトランスポゼース、及びインヒビタータンパク質(IS1InsAタンパク質、IS3OrfAタンパク質)の精製;IS1、IS3の転移反応の生化学的解析を行うために、これらのタンパク質をポリヒスチジンのタグ(His-tag)との融合タンパク質の形で大腸菌内で過剰産生ずることを試みた。その結果、IS1のトランスポゼース及びInsAタンパク質、IS3のOrfAタンパク質の過剰産生に成功し、これらをHis-tagにアフィニティーをもつNi-NTA力ラムによるクロマトグラフィー、ゲルろ過法などで精製した。残念ながら、IS3のトランスポゼースについては、様々な条件で過剰産生を試みたが、成功には至っていない。(3) 精製タンパク質の生化学的解析;精製したIS1のトランスポゼース及びInsAタンパク質のIs末端の逆向き反復配列への結合能を調べたところ、どちらのタンパク質も逆向き反復配列特異的なDNA結合活性を持つことがわかった。現在、IS3のOrfAタンパク質のDNA結合活性、IS1のトランスポゼースのISの末端でのDNA鎖の切断活性について検討中である。(4) IS3の遺伝子発現におけるRRFの関与;翻訳の終結反応に必須なribosome rec ycIing factor(RRF)の変異によって、IS3のorfBの開始コドンを改変した遺伝子の翻訳開始が異常になることを発見した。

(1)IS1, IS3 and host factor identification; IS1, IS3, IS4, IS5, IS6, IS7, IS8, IS9, IS9, IS (IHF,H-NS,HU,FIS,StpA,Dps,Hfq), component correlation [RecQ,RuvCJ), IS shift energy, cyclic IS molecule generation, presence or absence of modulation, H-NS deficient strain, IS1 shift, H-NS IS1 shift, host factor. (2)IS1 and IS3 were purified from the mixture of IS1 and IS3 and purified from the mixture of IS1 and IS3. The biochemical analysis of IS1 and IS3 was carried out. Results, IS1 and InsA properties, IS3 OrfA properties and production success, His-tag properties, Ni-NTA properties and production process. The condition of the system IS to produce a test result, and the result is successful. (3)The biochemical analysis of the purified substance; the purification of IS1 and the reverse alignment of the terminal of IS1; the binding energy of IS1 and the reverse alignment of IS1; and the DNA binding activity of IS1 and IS1. Now, the DNA binding activity of IS3 and the DNA cleavage activity of IS1 are under discussion. (4)IS3's gene discovery is related to the RRF; the end of the inversion is related to the ribosome rec ycIing factor(RRF); the start of the IS3's orfB is related to the start of the inversion.