大腸菌の挿入因子IS3の転移機構に関する研究

大肠杆菌插入因子IS3易位机制研究

• 批准号: 07780591
• 负责人: 関根 靖彦
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780591/
• 关键词: トランスポゾン; 挿入因子; トランスポゼ-ス; 転移反応

1. IS3トランスポゼ-ス過剰生産条件下で生じるDNA産物の構造解析及び、その生成機序の解明IS3のトランスポゼ-ス(Tnp)遺伝子を、アラビノースにより誘導可能なプロモーターの支配下においたプラスミドを構築した。このプラスミドを保持する大腸菌中で誘導条件下でのみ、環状及び直鎖状IS3分子が生じた。この結果は、このような特殊な構造を持つ分子がTnpの作用によって生じることを示し、これらの分子が転移反応の中間体であることを示唆する。このとき生じる直鎖状IS3分子の構造をプライマー伸長法等で解析した結果、この分子は5'端に3塩基の突出配列を有していた。また、Tnpを誘導産生すると、環状IS3分子が直鎖上IS3分子に変換されることを発見した。この結果は、IS3の転移反応が、(1)環状IS3分子の切り出し、(2)環状IS3分子から直鎖状IS3分子への変換、(3)直鎖状IS3分子の標的への組み込み、という経路で進行することを示唆する。2. IS3の転移頻度測定系の構築:クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm^r)を付与したIS3をもつプラスミドを作成した。このプラスミドと転移の標的プラスミドを共存させた大腸菌を一定時間培養した後、この菌体から調製したプラスミドDNAをエレクトロポーレーションで受容菌に導入した。Cm^rを示すコロニーが得られ、その個数から転移頻度は6x10^<-5>/cell divisionと算出された。3. IS3がコードするトランスポゼ-スの大量生産: T7プロモーターの下流にIS3のトランスポゼ-ス遺伝子をつなぎ、IPTG添加で誘導されるT7RNAポリメラーゼによる強い転写を利用してトランスポゼ-スを過剰に生産できるプラスミドを構築した。このプラスミドを用いてトランスポゼ-スの過剰生産を試みたが、期待していた生産はみられず、現在この点を改善すべく条件を検討しているところである。

1. Analysis of the structure of IS3 DNA products produced under different production conditions and the analysis of the production mechanism of IS3 DNA products. Under induction conditions in E. coli, IS3 molecules in the form of rings, rings and chains are produced. The results show that the special structure of the molecule is related to the interaction of Tnp. The molecular structure of the straight-chain IS3 molecule was analyzed by elongation method, and the molecular structure of the 5'-terminal IS3 group was arranged. The cyclic IS3 molecule is directly linked to the IS3 molecule. The results are as follows: (1) IS3 molecule transition;(2) IS3 molecule transition;(3) IS3 molecule transition;(4) IS3 molecule transition;(5) IS3 molecule transition;(6) IS3 molecule transition;(7) IS3 molecule transition;(8) IS3 molecule transition;(9) IS3 molecule transition;(10) IS3 molecule transition;(11) IS3 molecule transition;(12) IS3 molecule transition;(13) IS3 molecule transition;(14) IS3 molecule transition;(15) IS3 molecule transition;(16) IS3 molecule transition;(17) IS3 molecule transition;(18) IS3 molecule transition;(19) IS3 molecule transition;(10) IS3 molecule transition;(10) IS3 molecule transition;(19) IS3 molecule transition;(10) IS3 molecule transition;( 2. The construction of IS3 shift frequency measurement system: The IS3 shift frequency measurement system IS composed of the following components: After a certain period of time, the bacteria are transferred to the host cell. Cm^r is calculated from the number of cells obtained and the frequency of cell shifts calculated from 6x10^<-5>/cell division. 3. Mass production of IS3: downstream of IS3: T7 RNA: T7RNA: T7RNA This is the first time that we've had a chance to improve the quality of our products.

项目成果

E. Ohtsubo: "Bacterial Insertion sequences" Current Topics in Microbiology and Lmmunology. 204. 1-25 (1996)

E. Ohtsubo：“细菌插入序列”微生物学和免疫学当前主题。

Y. Sekine: "Ident-fication and chara terization of livear IS3 molecules generated by staggered breaks" J. Biol. Chem.271. 197-202 (1996)

Y. Sekine：“交错断裂产生的肝 IS3 分子的鉴定和表征”J. Biol。