大腸菌の挿入因子IS3の転移機構に関する研究

1. IS3トランスポゼ-ス過剰生産条件下で生じるDNA産物の構造解析及び、その生成機序の解明IS3のトランスポゼ-ス(Tnp)遺伝子を、アラビノースにより誘導可能なプロモーターの支配下においたプラスミドを構築した。このプラスミドを保持する大腸菌中で誘導条件下でのみ、環状及び直鎖状IS3分子が生じた。この結果は、このような特殊な構造を持つ分子がTnpの作用によって生じることを示し、これらの分子が転移反応の中間体であることを示唆する。このとき生じる直鎖状IS3分子の構造をプライマー伸長法等で解析した結果、この分子は5'端に3塩基の突出配列を有していた。また、Tnpを誘導産生すると、環状IS3分子が直鎖上IS3分子に変換されることを発見した。この結果は、IS3の転移反応が、(1)環状IS3分子の切り出し、(2)環状IS3分子から直鎖状IS3分子への変換、(3)直鎖状IS3分子の標的への組み込み、という経路で進行することを示唆する。2. IS3の転移頻度測定系の構築:クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm^r)を付与したIS3をもつプラスミドを作成した。このプラスミドと転移の標的プラスミドを共存させた大腸菌を一定時間培養した後、この菌体から調製したプラスミドDNAをエレクトロポーレーションで受容菌に導入した。Cm^rを示すコロニーが得られ、その個数から転移頻度は6x10^<-5>/cell divisionと算出された。3. IS3がコードするトランスポゼ-スの大量生産: T7プロモーターの下流にIS3のトランスポゼ-ス遺伝子をつなぎ、IPTG添加で誘導されるT7RNAポリメラーゼによる強い転写を利用してトランスポゼ-スを過剰に生産できるプラスミドを構築した。このプラスミドを用いてトランスポゼ-スの過剰生産を試みたが、期待していた生産はみられず、現在この点を改善すべく条件を検討しているところである。

1. IS3トランスポゼ-ス過剰生産条件下で生じるDNA産物の構造解析及び、その生成機序の解明IS3のトランスポゼ-ス(Tnp)遺伝子を、アラビノースにより誘導可能なプロモーターの支配下においたプラスミドを構築した。このプラスミドを保持する大腸菌中で誘導条件下でのみ、環状及び直鎖状IS3分子が生じた。この結果は、このような特殊な構造を持つ分子がTnpの作用によって生じることを示し、これらの分子が転移反応の中間体であることを示唆する。このとき生じる直鎖状IS3分子の構造をプライマー伸長法等で解析した結果、この分子は5'端に3塩基の突出配列を有していた。また、Tnpを誘導産生すると、環状IS3分子が直鎖上IS3分子に変換されることを発見した。この結果は、IS3の転移反応が、(1)環状IS3分子の切り出し、(2)環状IS3分子から直鎖状IS3分子への変換、(3)直鎖状IS3分子の標的への組み込み、という経路で進行することを示唆する。2. IS3の転移頻度測定系の構築:クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm^r)を付与したIS3をもつプラスミドを作成した。このプラスミドと転移の標的プラスミドを共存させた大腸菌を一定時間培養した後、この菌体から調製したプラスミドDNAをエレクトロポーレーションで受容菌に導入した。Cm^rを示すコロニーが得られ、その個数から転移頻度は6x10^<-5>/cell divisionと算出された。3. IS3がコードするトランスポゼ-スの大量生産: T7プロモーターの下流にIS3のトランスポゼ-ス遺伝子をつなぎ、IPTG添加で誘導されるT7RNAポリメラーゼによる強い転写を利用してトランスポゼ-スを過剰に生産できるプラスミドを構築した。このプラスミドを用いてトランスポゼ-スの過剰生産を試みたが、期待していた生産はみられず、現在この点を改善すべく条件を検討しているところである。