大腸菌の全tRNA修飾酵素遺伝子の同定とtRNA修飾塩基の網羅的機能解析

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1 大腸菌の遺伝子破壊株を用いた大腸菌全tRNA修飾酵素遺伝子の同定(関根・鈴木)(1)RNA修飾酵素の網羅的探索のためには、多くの機能未知遺伝子(または機能既知遺伝子)の破壊株の培養、細胞からのRNA抽出とその解析を効率的に行う必要がある。そこで、ディープウェルプレートを用いた大腸菌の培養と96ウェルのタイタープレートを用いたRNA抽出により、1日あたり196サンプルのペースでサンプルが調製できるシステムを開発した。高速液体クロマトグラフィー質量分析装置(LC/MS)を用いた分析法もすでに検討を終了し、1日あたり19サンプルの自動分析が可能となった。これにより、1ヶ月の自動分析で約600サンプルを処理することができる体制が整った。(2)当初の計画では、大腸菌の各遺伝子の破壊株を1つ1つ解析する予定であったが、それに先立って、より効率良くtRNA修飾酵素遺伝子を探索するために、大腸菌ゲノムの広範囲ゲノム欠失変異株[加藤潤一博士(都立大)作製]及びYale大CGSCより取り寄せた広範囲ゲノム欠失変異株からRNAを抽出し、その分析を行った。その結果、13株で修飾の欠損が観測された。このうち3株については既知の修飾酵素遺伝子がゲノムの欠失領域に含まれることから、残りの10株は新規の修飾酵素遺伝子を欠失していることになる。欠損が観測された修飾塩基は、s2U, ac4C, Q, cmo5U, m7G, mnm5s2Uなどである。これら欠失領域中には10〜20個の遺伝子が含まれている。今後は、欠失領域中のどの遺伝子が修飾酵素遺伝子であるのかを決定していく予定である。なお、この広範囲ゲノム欠失変異株の解析により、既に大腸菌の1968個のORFについての探索を行ったことになる。