大腸菌の挿入因子ISの転移とその制御の分子機構

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1.IS3トランスポゼースによる融合体形成反応の解析:IS3トランスポゼースにより形成される、IS3を運ぶプラスミド(ドナー)と標的プラスミドの融合体の構造解析の結果、融合体はドナーと標的の境界部分を含む領域を欠失していることがわかった。一方、IS3の内部を大きく欠失させたミニIS3を運ぶドナーを用いた場合、生じたすべての融合体は欠失を持たなかった。以上の結果はIS3の内部配列に融合体形成時のDNA複製を阻害する配列が存在することを示唆する。2.IS3トランスポゼースの精製とそれを用いた転移反応の素過程の解析:IS3トランスポゼースをマルトース結合タンパク質との融合タンパク質の形で精製した。得られたトランスポゼースをIS3を運ぶプラスミドに作用させたところ、ISの一方のDNA端がもう一方の端につなぎ換わる反応がおこった。一方、トランスポゼースを環状IS3を運ぶプラスミドに作用させたところ、IS末端でのDNA鎖の切断が起こることがわかった。以上の結果はIS3の転移反応の素過程がIS3トランスポゼースのみでin vitroで再現できたことを示す。3.IS1の転移に必須な宿主因子H-NSの解析:(1)ゲルシフト法により、H-NSはIS1の配列に特異的には結合しないことがわかった。(2)H-NSの各ドメインに変異をもつhns遺伝子の存在下でIS1の転移能を調べた結果、IS1の転移にはH-NSのDNA結合ドメインは不要で、ダイマー形成ドメインが必要であることがわかった。これらの結果から、H-NSはIS1のDNAに直接結合するのではなく、恐らくトランスポゼースと相互作用することによってIS1の転移を起こさせると考えられる。