Brassica rapaの形質転換系の確立および巨大ゲノム断片の導入に関する研究

平成10年度に作製したB.RapaゲノムDNAのBACライブラリーからSLG,SRK遺伝子を含むクローンをスクリーニングした。既にスクリーニングを終えた20000クローンを除く残り50000クローンのBACライブラリーを雌しべ側自家不和合性遺伝子であるSLG、SRK遺伝子をプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーションを行ったところ、5つのポジティブクローンが得られた。これらのコロニーを鋳型としてそれぞれの遺伝子を増幅するプライマーを用いてPCR増幅したところ、72kbの断片を含む1クローンのみが両遺伝子を含み、残りのクローンはSLG遺伝子が欠けていた。そこで72kbの断片を含むクローンを用いてSRK遺伝子周辺をシークエンスしたところ、SRK遺伝子の約10kb上流に他のS系統で明らかになった花粉発現遺伝子SP11遺伝子とアミノ酸配列で約40%の相同性を示す遺伝子が見つかった。シグナル配列部分を他の系統で得られたSP11遺伝子の配列と比較すると、70%以上の相同姓を示し、また8つのシステイン残基が保存されていることからこの遺伝子はSP11遺伝子であると断定した。次にSLG、SRK、SP11遺伝子間でlong and accurate(LA)PCRを行ったところ、SP11遺伝子はSLG遺伝子とSRK遺伝子間に位置し、それぞれの距離は約22kb,9kbであった。現在、上記72kbのクローンを制限酵素NotIを用いて切り出し、バイナリーBACベクターpBIGRZへの導入を試みている。今後、バイナリーBACベクターに導入したクローンを、B.Rapaに近縁で自家和合性を示すアラビドプシスに導入して自家不和合性が獲得されるかどうかを明らかにしたいと考えている。

平成10年度に作製したB.RapaゲノムDNAのBACライブラリーからSLG,SRK遺伝子を含むクローンをスクリーニングした。既にスクリーニングを終えた20000クローンを除く残り50000クローンのBACライブラリーを雌しべ側自家不和合性遺伝子であるSLG、SRK遺伝子をプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーションを行ったところ、5つのポジティブクローンが得られた。これらのコロニーを鋳型としてそれぞれの遺伝子を増幅するプライマーを用いてPCR増幅したところ、72kbの断片を含む1クローンのみが両遺伝子を含み、残りのクローンはSLG遺伝子が欠けていた。そこで72kbの断片を含むクローンを用いてSRK遺伝子周辺をシークエンスしたところ、SRK遺伝子の約10kb上流に他のS系統で明らかになった花粉発現遺伝子SP11遺伝子とアミノ酸配列で約40%の相同性を示す遺伝子が見つかった。シグナル配列部分を他の系統で得られたSP11遺伝子の配列と比較すると、70%以上の相同姓を示し、また8つのシステイン残基が保存されていることからこの遺伝子はSP11遺伝子であると断定した。次にSLG、SRK、SP11遺伝子間でlong and accurate(LA)PCRを行ったところ、SP11遺伝子はSLG遺伝子とSRK遺伝子間に位置し、それぞれの距離は約22kb,9kbであった。現在、上記72kbのクローンを制限酵素NotIを用いて切り出し、バイナリーBACベクターpBIGRZへの導入を試みている。今後、バイナリーBACベクターに導入したクローンを、B.Rapaに近縁で自家和合性を示すアラビドプシスに導入して自家不和合性が獲得されるかどうかを明らかにしたいと考えている。