高血圧発症における血管平滑筋由来リゾホスファチジン酸受容体活性化の役割

本年度は、昨年度の実験結果に基づき以下の実験を行った。デジェネレートプライマーを用いたRT-PCRにより得られた独立した7個(SHR:高血圧自然発症ラット)および11個(WKY:正常血圧ラット)のcDNAクローンをシーケンスしたところ、SHAでは4個が、WKYでは5個がオープンリーディングとなっていた。その中には、すでにcDNAクローニングされているリゾホスファチジン酸受容体であるヒト由来EDG4ホモログと新規のcDNA(SH1)が含まれていた。EDG4ホモログについて5'ー及び3'ーRACE法によりcDNA全長をとり、核酸配列ならびに、アミノ酸配列を、SHRとWKYで比較したところ両者間で差はみられなかった。更に、SH1について同様に5'ー及び3'RACE法によりcDNA全長をとり、アミノ酸配列を調べたところ、7つの脂溶性の高い部位が存在し、LPA受容体と同様にGTP結合タンパクにカップルする受容体ファミリーに属していることが予想された。このSH1cDNA全長を哺乳類細胞での発現ベクター(pcDNA3)に挿入し、ヒト白血球由来細胞(Jurkat cell)において一過的に大量発現を行い、[^3H]LPAを用いて結合実験を行った結果、[^3H]LPAの特異的結合数がコントロール(pcDNA3のみ)に比べて顕著に増加していた。以上の結果からSH1は新規のLPA受容体である可能性が考えられた。

本年度は、昨年度の実験結果に基づき以下の実験を行った。デジェネレートプライマーを用いたRT-PCRにより得られた独立した7個(SHR:高血圧自然発症ラット)および11個(WKY:正常血圧ラット)のcDNAクローンをシーケンスしたところ、SHAでは4個が、WKYでは5個がオープンリーディングとなっていた。その中には、すでにcDNAクローニングされているリゾホスファチジン酸受容体であるヒト由来EDG4ホモログと新規のcDNA(SH1)が含まれていた。EDG4ホモログについて5'ー及び3'ーRACE法によりcDNA全長をとり、核酸配列ならびに、アミノ酸配列を、SHRとWKYで比較したところ両者間で差はみられなかった。更に、SH1について同様に5'ー及び3'RACE法によりcDNA全長をとり、アミノ酸配列を調べたところ、7つの脂溶性の高い部位が存在し、LPA受容体と同様にGTP結合タンパクにカップルする受容体ファミリーに属していることが予想された。このSH1cDNA全長を哺乳類細胞での発現ベクター(pcDNA3)に挿入し、ヒト白血球由来細胞(Jurkat cell)において一過的に大量発現を行い、[^3H]LPAを用いて結合実験を行った結果、[^3H]LPAの特異的結合数がコントロール(pcDNA3のみ)に比べて顕著に増加していた。以上の結果からSH1は新規のLPA受容体である可能性が考えられた。