RAP-PCR法を用いた腸管出血性大腸菌感染に対する腸管上皮細胞の発現遺伝子の解析

RAP-PCR法分析肠上皮细胞响应肠出血性大肠杆菌感染的基因表达

基本信息

批准号：
10770116
负责人：
中川一路
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

平成10年度は、腸管上皮細胞株を用いて腸管出血性大腸菌感染時に発現する遺伝子を解析した。その結果、使用した上皮細胞株いずれにおいても炎症性サイトカインであるIL-1β、IL-6及びTNF-αの遺伝子発現の増強が認められた。さらに、HGFのレセプターであるc-met遺伝子の発現が著しく抑制されることを明らかとした。さらに、平成11年度は、腸管出血性大腸菌の産生する志賀毒素の機能に注目し、これらの遺伝子のクローニングを行い、発現系を構築した。さ志賀毒素A,Bサブユニット各遺伝子をテトラサイクリン誘導プロモーター支配下で発現するほ乳細胞の発現系を構築し、細胞内でのこれらの毒素の機能の解析を行った。その結果、Aサブユニットをテトラサイクリン添加によって細胞内に発現させた細胞では急速な細胞の壊死が認められた。一方、Bサブユニットを発現させた細胞では細胞の自殺すなわちアポトーシスの顕著な誘導が認められた。Bサブユニットを発現させた細胞ではカスパーゼ1,3の発現誘導が顕著に認められ、炎症性サイトカインであるIL-1β、TNF-αの産生の増強が、ELISA法によって認められた。従来、志賀毒素の機能発現にはAサブユニットによるタンパク合成阻害作用が中心であり、Bサブユニットは細胞への結合にのみ働くと考えられてきたが、この研究によって細胞内に取り込まれたBサブユニットは細胞内でカスパーゼカスケードを活性化することによって細胞毒性を発揮する可能性があることが示唆された。

1998年，使用肠上皮细胞系分析了在肠肠肠肠肠球大肠杆菌感染期间表达的基因。结果，在所有使用的上皮细胞系中，增强了炎性细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α的基因表达。此外，揭示了C-Met基因的表达是HGF的受体，被显着抑制。此外，在1999年，我们重点关注肠ha骨大肠杆菌产生的志贺毒素的功能，并克隆了这些基因以构建表达系统。在诱导四环素诱导启动子的控制下构建了一种表达玉米饼基因基因的哺乳动物细胞的表达系统，并在细胞中分析了这些毒素的功能。结果，在通过添加四环素在细胞中表达A亚基的细胞中观察到快速细胞坏死。另一方面，表达B亚基的细胞显示出明显的细胞自杀诱导，即凋亡。在表达B亚基的细胞中诱导caspase 1和3的表达是显着的，ELISA观察到炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的产生的增强。传统上，Shiga毒素的表达主要涉及A亚基对蛋白质合成的抑制，并且人们认为B亚基仅对细胞结合起作用，但是这项研究表明，在细胞内吸收的B亚基可能会通过激活细胞内的caspase cascade施加细胞毒性。