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CaMキナーゼホスファターゼの活性制御機構と生理機能の解明に関する研究

CaM激酶磷酸酶活性调控机制及生理功能研究

基本信息

批准号：
12780462
负责人：
石田敦彦
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780462/
关键词：
プロテインホスファターゼプロテインキナーゼ CaMキナーゼホスファターゼ脱リン酸化ポリカチオン多機能性カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ活性化機構核タンパク質生化学酵素反応速度論合成リン酸化ペプチド基質特異性カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ

项目摘要

CaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP)は多機能性CaMキナーゼを脱リン酸化して制御すると考えられる新規プロテインホスファターゼである。本酵素はポリカチオンによって顕著な活性化を受けるので、この活性化の機構について検討した。32PでラベルしたCaMキナーゼIV(CaMKIV)を基質として各種poly-L-Lys(PLL)の活性化能を比較したところ、PLLの分子量の増加とともに活性化能は増大した。この活性化能は高濃度のNaCl存在下では著明に低下した。また、プロタミンやヒストンなどの塩基性蛋白質にも活性化能が認められた。表面プラズモン共鳴法によってPLLとCaMKP並びにPLLとCaMKIVの相互作用を調べたところ、CaMKPとCaMKIVは何れもPLLに極めて強固に結合することが判明した。次にCaMKPを固定化した樹脂を利用してCaMKIVの結合実験を試みたところ、CaMKPと高分子量PLL共存下でのみCaMKIVの樹脂への結合が認められた。予めCaMKP, PLL, [32P]CaMKIVの三者をプレインキュべートし、順次これを希釈してホスファターゼ活性を測定すると比活性は希釈倍率に依存せず、ほぼ一定の値を示した。従ってこの三者は強固な複合体を形成しているものと考えられる。更にCaMKPの一次構造中101-109に存在するGluクラスターを削除したミュータントを作製して調べたところ、このミュータントではPLLによる活性化、及びマンガン存在下におけるPLLへの結合能が完全に消失していた。以上の結果からポリカチオンによるCaMKPの活性化にはポリカチオンを介したCaMKPと基質タンパク質との強固な複合体形成が重要であり、CaMKPの101-109のGluクラスターがこの活性化に必須であることが強く示唆された(論文投稿準備中)。また、ヒトのCaMKPはラットCaMKPと79%のホモロジーがあるが、このヒトCaMKPの配列を用いてデータべースをブラストサーチしたところ、ヒトCaMKPと64%のホモロジーのある領域を有する新規ホスファターゼをコードするcDNAクローンが見出された。この酵素(CaMKP-N)は脳に特異的に発現しており、また細胞内では核に局在することが判明した。cDNAをSf9細胞にて発現させて得られた部分精製酵素を用いて、この酵素の生化学的性質を調べたところ、基質特異性や金属・ポリカチオン要求性などの点でCaMKPと類似した性質を示すことが明らかとなった。また酵素のC末ドメインに核局在シグナルが存在することも判明した。CaMKPとCaMKP-Nは組織分布が全く異なるので、両者は何らかの相補的な役割を果たしている可能性が考えられる。

CaMKP is multifunctional CaMKP The enzyme is activated by the enzyme and the enzyme is activated by the enzyme 32P, CaMKIV, CaMKIV, Ca The activation energy of this enzyme decreases in the presence of high concentrations of NaCl. The activity of basic proteins is recognized by the following methods: The interaction between PLL and CaMKP and PLL and CaMKIV is modulated by the resonance method, and the interaction between CaMKP and CaMKIV and PLL is strongly determined. In addition, CaMKP was immobilized on the resin. The binding mechanism of CaMKIV was studied. The binding mechanism of CaMKP and high molecular weight PLL was studied. CaMKP, PLL, [32P]CaMKIV are the three main components of the system. The formation of a strong complex of three elements In addition, in the primary structure of CaMKP 101-109, the binding energy of PLL is completely eliminated in the presence of Glu and Glu, and PLL is activated in the presence of Glu and Glu. The above results show that the activation of CaMKP is important for the formation of CaMKP and matrix complexes, and the activation of CaMKP 101-109 is necessary for the formation of CaMKP and matrix complexes (paper preparation). CaMKP is 79% of the CaMKP gene. CaMKP is 64% of the CaMKP gene. This enzyme (CaMKP-N) is specifically identified in the intracellular system. cDNA is produced in Sf9 cells, and some of the enzymes are used. The biochemical properties of the enzymes are regulated by the matrix. The presence of the enzyme in the cell was detected. CaMKP and CaMKP-N are different in organization distribution, and the possibility of the division of CaMKP and CaMKP-N is examined.