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カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIIのカルモデュリンによる不活性化機構の研究

钙调蛋白对钙调蛋白依赖性蛋白激酶II的灭活机制研究

基本信息

批准号：
06780475
负责人：
石田敦彦
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Ca^<2+>/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(CAMKII)を30℃でCa^<2+>/カルモデュリン(Ca^<2+>/CaM)とともにインキュベートすると酵素活性の速やかな不活性化が観察された。この不活性化の前後でCAMKIIの分解はSDS-PAGE上観察されず、またプロテアーゼ阻害剤の添加によって不活性化は全く抑制されなかった。これに対し、EGTAやCaMアンタゴニストであるトリフルオペラジン、W-7によって不活性化は完全に抑制された。これらのことから、この不活性化は確かにCa^<2+>/CaMに依存した過程であることが示された。不活性化反応速度はCa^<2+>/CaM濃度に依存し、最大不活生化速度の1/2を与えるCa^<2+>/CaM濃度は127μMと活性化に要するCa^<2+>/CaM濃度に比べると、はるかに高濃度を要した。また、キモトリプシン処理によってCa^<2+>/CaM結合部位を含む自己阻害ドメインを取り除いたCAMKIIフラグメントを用いても同様のCa^<2+>/CaMに依存した不活性化が観察された。以上のことから、この不活性化には従来考えられていたCa^<2+>/CaM結合部位とは異なる低親和性の第2のCa^<2+>/CaM結合部位が関与していることが示唆された。この結果不活性化は温度依存性であり、20μMのCa^<2+>/CaM存在下では20℃以上の温度における熱安定性が急激に低下した。500μM ADPおよび10mM MgCl_2はそれぞれ単独では不活性化に殆ど影響を及ぼさなかったが、同時添加によって不活性化を顕著に抑制した。本酵素の良好な合成ペプチド基質であるsyntide-2は304μMという高濃度で添加しても不活性化に全く影響を及ぼさず、また良好な蛋白質であるMAP2はむしろ不活性化を促進した。これらに対し、本酵素の自己阻害ドメインを模した合成ペプチド基質であるautocamtide-2は5μMという低濃度で不活性化を著明に抑制した。本研究の結果、CAMKIIの活性発現に必須であるCa^<2+>/CaMは、高濃度に存在すると逆に速やかな酵素の不活性化を引き起こすということが明らかとなった。このことは本酵素の活性が高親和性と低親和性の2つのCa^<2+>/CaM結合部位によって制御されている可能性を示唆しており、。その機構や生理的意義について興味が持たれる。

Ca^<2+>/Ca^<2+>/CaM ^<2 +>/CaM ^< The decomposition of CAMKII before and after inactivation was observed on SDS-PAGE, and the inactivation was completely inhibited by the addition of inhibitors. For example, EGTA and CaM can completely suppress the inactivation of W-7. Ca^<2+>/CaM is a process of inactivation. The inactivation rate depends on Ca^<2+>/CaM concentration, and the maximum inactivation rate is 1/2 of Ca^<2+>/CaM concentration, which is 127μM higher than Ca^<2+>/CaM concentration. The Ca^<2+>/CaM binding sites were selected from the CAMKII binding sites, and the Ca^<2+>/CaM binding sites were inactivated. The Ca ^<2+>/CaM binding site is different from the Ca^<2 +>/CaM binding site with low affinity. As a result, the inactivation was temperature dependent, and the thermal stability was rapidly reduced at temperatures above 20℃ in the presence of 20μM Ca^<2+>/CaM. 500μM ADP and 10mM MgCl_2 can inhibit the inactivation independently and simultaneously. The enzyme is well synthesized in the substrate, and its synthesis is promoted by the addition of a high concentration of syntide-2 at 304μM to inactivate the enzyme. This enzyme inhibits the synthesis of autocamtide-2 at low concentrations such as 5μM. As a result of this study, the activity of CAMKII requires Ca^<2+>/CaM, and high concentrations of Ca ^<2 +>/CaM are present. The activity of this enzyme varies from high affinity to low affinity, and the Ca^<2+>/CaM binding site may be controlled. The mechanism and physiological meaning of the body are not interesting.