COLD-PCRによる遺伝子変異エンリッチ法の確立と肺癌の体液診断への応用

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新しく考案されたCOLD-PCRは遺伝子変異を濃縮する方法として有効である。そこで今回、COLD-PCRを用いてK-ras変異の検出系を構築し、臨床材料への応用を試みた。癌細胞株を用いた検出感度の実験をまず行った。NEDATEから抽出したDNAを正常型DNAで1:10から1:200の割合に段階的に希釈し、full COLD-PCRおよびconventional nested PCRで増幅した。conventional nested PCRによる増幅産物は、塩基配列決定法では1:20希釈で、SSCP法では1:50希釈で、変異型を検出できなくなった。しかしながら、full COLD-PCRによる増幅産物は、塩基配列決定法でもSSCP法でも200倍希釈の変異型が明らかに検出できた。他の2種類の変異型もfull COLD-PCRの方が少ない変異型を高感度に検出することができた。よって、COLD-PCRは変異型の濃縮に有用であり、少量の変異型を含む臨床材料を使用する際にも変異型のスクリーニングに有効であることが判明した。また、COLD-PCRとSSCP法の組合せは塩基配列決定法などに比べて高感度であり、簡便であると考えられた。SSCP法には分離することで量的な解析を行えるとともに分離アレルの遺伝型を同定できるという大きな利点を有するが、時間と手間がかかるという欠点があるため、COLD-PCR産物をそのまま高感度融解温度解析(high resolution melting ; HRM)で変異型の検出が可能かどうかを検討した。その結果、通常のnested PCRよりCOLD-PCRで感度が高かったが、SSCP法よりもその優位性は劣っていた。ただ、自動化、多検体処理が可能であるという大きな利点を有した。これから、このHRMとSSCP法を比較しながら、臨床検体での検討を行う。