生殖腺体細胞との共培養によるメダカ始原生殖細胞の体外培養

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申請者はこれまでに魚類始原生殖細胞(PGC)が凍結保存できることを明らかにしたが、本研究ではPGCを体外にて増殖、配偶子へ分化誘導することを目標に、PGCが赤色蛍光を発するolvas-DsRedトランスジェニックメダカを用いて以下の実験を行った。1、既存マウス由来株化細胞のフィーダー細胞化マウス由来のTM4とSL10という2種類の株化細胞を用い、「温度:28℃、培地:L-15+コイ血清5%」の培養条件下にてPGCとの共培養を行ったところ、両細胞株どちらにおいても増殖とコロニー化は確認されず、マウス由来細胞ではマッチしない可能性が示唆された。2、メダカ由来フィーダー細胞の樹立有用因子を分泌していると考えられるメダカ生殖腺体細胞と、サイトカイン分泌細胞である脾臓細胞をフィーダー細胞として用いるべく、培養法の検討を行った。生殖腺体細胞は培地中に胚抽出液を添加する事で維持・増殖が可能であった。現在、発現因子をmRNAレベルで解析を行っている。脾臓細胞は高濃度での播種及びPWMを培地中に添加することで活発な増殖・維持が可能であることが分かったため、今後はフィーダー細胞としてPGCと共培養を行う予定である。3、因子の漆加培地中へ有用因子の直接添加を行なう事によって、増殖性や生存性に変化があるか検討した。PGCは移動期である受精後3日(3dpf)と定着期である6日(6dpf)胚由来を用いた。その結果、SCF、FGF2、BMP4、TSAを加えた試験区は3dpfと6dpf由来のどちらにおいても、PGCの増殖とコロニー化が確認され、また以前の結果と比較して、PGC数とコロニー形成率の増加傾向が確認された。特に3dpf由来PGCでは、増殖率とコロニー形成率共に他の試験区と比較して有意に上昇した。この結果から、移動期のPGCを用いることが重要であることが示唆された。