生殖腺体細胞との共培養によるメダカ始原生殖細胞の体外培養

青鳉原始生殖细胞与性腺体细胞共培养的体外培养

• 批准号: 22925029
• 负责人: 川辺 敏晃
• 金额: $ 0.34万
• 依托单位: アーク・リソース株式会社
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22925029/
• 关键词: メダカ; 始原生殖細胞; 体外培養

申請者はこれまでに魚類始原生殖細胞(PGC)が凍結保存できることを明らかにしたが、本研究ではPGCを体外にて増殖、配偶子へ分化誘導することを目標に、PGCが赤色蛍光を発するolvas-DsRedトランスジェニックメダカを用いて以下の実験を行った。1、既存マウス由来株化細胞のフィーダー細胞化マウス由来のTM4とSL10という2種類の株化細胞を用い、「温度:28℃、培地:L-15+コイ血清5%」の培養条件下にてPGCとの共培養を行ったところ、両細胞株どちらにおいても増殖とコロニー化は確認されず、マウス由来細胞ではマッチしない可能性が示唆された。2、メダカ由来フィーダー細胞の樹立有用因子を分泌していると考えられるメダカ生殖腺体細胞と、サイトカイン分泌細胞である脾臓細胞をフィーダー細胞として用いるべく、培養法の検討を行った。生殖腺体細胞は培地中に胚抽出液を添加する事で維持・増殖が可能であった。現在、発現因子をmRNAレベルで解析を行っている。脾臓細胞は高濃度での播種及びPWMを培地中に添加することで活発な増殖・維持が可能であることが分かったため、今後はフィーダー細胞としてPGCと共培養を行う予定である。3、因子の漆加培地中へ有用因子の直接添加を行なう事によって、増殖性や生存性に変化があるか検討した。PGCは移動期である受精後3日(3dpf)と定着期である6日(6dpf)胚由来を用いた。その結果、SCF、FGF2、BMP4、TSAを加えた試験区は3dpfと6dpf由来のどちらにおいても、PGCの増殖とコロニー化が確認され、また以前の結果と比較して、PGC数とコロニー形成率の増加傾向が確認された。特に3dpf由来PGCでは、増殖率とコロニー形成率共に他の試験区と比較して有意に上昇した。この結果から、移動期のPGCを用いることが重要であることが示唆された。

The applicant is responsible for the freezing and preservation of fish primordial germ cells (PGC). In this study, PGC was cultured in vitro and induced to differentiate into mating offspring. PGC was used for the following purposes: 1. Under the culture conditions of "temperature:28℃, culture medium:L-15+ serum 5%", the co-culture of PGC and PGC was carried out under the conditions of "culture medium:L-15+ serum 5%". 2. The development of useful factors in reproductive gland cells and secretory cells in spleen cells. The germ gland cells were cultured in embryo extract and maintained. Now, the expression factor mRNA is analyzed. Splenic cells are seeded and cultured in high concentrations, and growth and maintenance are possible. 3. The direct addition of useful factors in the development of factors and survival PGC migration period 3 days after fertilization (3dpf) fixation period 6 days (6dpf) embryo origin The results of SCF, FGF2, BMP4 and TSA were compared with those of previous studies. In particular, the 3dpf is derived from PGC, the growth rate and the formation rate of other test areas are intentionally increased. The result of this is that the PGC of the mobile phase is used in the middle of the game.