新規遺伝子を標的としたパイロシークエンス法による抗酸菌迅速同定検査法の確立

焦磷酸测序新基因快速鉴定抗酸菌检测方法的建立

• 批准号: 26931043
• 负责人: 三澤 慶樹
• 金额: $ 0.32万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26931043/
• 关键词: 抗酸菌迅速同定検査法; パイロシークエンス; KODポリメラーゼ

研究目的 : 非結核性抗酸菌(NTM)の同定には、迅速性に優れた検査法がなく、同定不能になることがしばしばある。本研究では、パイロシークエンス法による迅速かつ正確な抗酸菌同定法の構築を目的とする。研究方法1. 対象菌株と遺伝子抽出 : 当院で保存しているM. bovis BCGおよびATCC株17株(M. kansasii, M. marinum, M. simiae, M. scrofulaceum, M. gordonae, M. szulgai, M. avium, M. intracellulare, M. gastri, M. xenopi, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale, M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus, M. peregrinum)を対象とし、小川培地に発育させた集落をシリカビーズで破砕後、フェノール・クロロフォルム処理、エタノール抽出によりDNAを抽出した。抽出したサンプルは, 16S rRNA遺伝子配列を標的としたプライマーにてPCRを行うことでDNA抽出の確認を行った。2. プライマー設計プライマー設計にはNodaらが報告した抗酸菌59菌種のdnaJ遺伝子配列中、代表的な21菌種の塩基配列を基にDANASISにて比較し、菌種間で最も異なる配列領域を標的として、Pyrosequencing Assay Design Software(QIAGEN)を用いプライマー設計した。3. PCR・パイロシークエンスの条件設定および塩基配列の決定と菌種決定設計したプライマーを用いて、PCR・パイロシークエンス反応の条件を設定した。また、標準菌株の塩基配列をパイロシークエンスにより決定し、得られた配列と遺伝子ライブラリーとの相同性を確認することで菌種決定を評価した。研究結果 1. 遺伝子抽出DNA抽出したサンプルは、16S rRNA遺伝子配列を標的としたPCRにより、全ての菌株で十分量のDNAが抽出できたことを確認した。2. プライマー設計アライメント解析後、標的を幅広く設定しプライマー設計したところ、position 190-380領域が最も菌種間で異なる配列を持ち、かつプライマーが作成できるだけの共通領域を保持していたため、候補プライマーを30セット用意した。3. PCR・パイロシークエンスの条件設定および塩基配列の決定と菌種決定DNA抽出の迅速・簡略化を考慮し、KODポリメラーゼを用いたPCR条件設定を行った。M. gordonae以外の菌株でPCRによる標的領域の増幅を認めたが、全ての菌株で標的領域が増幅しなかったため、今後プライマーの再設計とPCR条件設定を更に見直す必要があると思われる。

Objective: To investigate the identification and rapidity of nontuberculous acid-fast bacteria (NTM). This study aims to establish a rapid and accurate method for the identification of acid-resistant bacteria. Methods 1. The strain of M. bovis BCG ATCC strain 17 strains (M. kansasii, M. marinum, M. simiae, M. scrofulaceum, M. gordonae, M. szulgai, M. avium, M. intracellulare, M. gastri, M. xenopi, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale, M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus, M. Peregrine), Ogawa culture, colony development, post-harvest, post-harvest, post-harvest DNA extraction 16S rRNA gene alignment target DNA extraction confirmation 2. The design of DNAJ gene alignment of 59 strains of acid-fast bacteria was reported by Noda. The gene alignment of 21 representative strains was compared with that of DANASIS. The most diverse alignment fields were identified by Pyrosequencing Assay Design Software(QIAGEN). 3. The conditions for PCR amplification are set, and the gene alignment is determined. The conditions for PCR amplification are set, and the strain is determined. The base alignment of standard strains is determined by the identification of the base alignment and the identity of the base alignment. Results 1. DNA extracted from the isolate was identified by PCR with 16S rRNA gene alignment markers. 2. After analysis, the target amplitude is set to 190-380, and the common domain is maintained, and the candidate amplitude is set to 30. 3. PCR condition setting and gene alignment determination, strain determination, DNA extraction, simplification, and KOD condition setting M. For strains other than gordonae, the amplification of PCR target domain is recognized, and for all strains, the amplification of PCR target domain is increased. In the future, the redesign of PCR target domain and the setting of PCR conditions are necessary.