新規遺伝子を標的としたパイロシークエンス法による抗酸菌迅速同定検査法の確立

研究目的 : 非結核性抗酸菌(NTM)の同定には、迅速性に優れた検査法がなく、同定不能になることがしばしばある。本研究では、パイロシークエンス法による迅速かつ正確な抗酸菌同定法の構築を目的とする。研究方法1. 対象菌株と遺伝子抽出 : 当院で保存しているM. bovis BCGおよびATCC株17株(M. kansasii, M. marinum, M. simiae, M. scrofulaceum, M. gordonae, M. szulgai, M. avium, M. intracellulare, M. gastri, M. xenopi, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale, M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus, M. peregrinum)を対象とし、小川培地に発育させた集落をシリカビーズで破砕後、フェノール・クロロフォルム処理、エタノール抽出によりDNAを抽出した。抽出したサンプルは, 16S rRNA遺伝子配列を標的としたプライマーにてPCRを行うことでDNA抽出の確認を行った。2. プライマー設計プライマー設計にはNodaらが報告した抗酸菌59菌種のdnaJ遺伝子配列中、代表的な21菌種の塩基配列を基にDANASISにて比較し、菌種間で最も異なる配列領域を標的として、Pyrosequencing Assay Design Software(QIAGEN)を用いプライマー設計した。3. PCR・パイロシークエンスの条件設定および塩基配列の決定と菌種決定設計したプライマーを用いて、PCR・パイロシークエンス反応の条件を設定した。また、標準菌株の塩基配列をパイロシークエンスにより決定し、得られた配列と遺伝子ライブラリーとの相同性を確認することで菌種決定を評価した。研究結果 1. 遺伝子抽出DNA抽出したサンプルは、16S rRNA遺伝子配列を標的としたPCRにより、全ての菌株で十分量のDNAが抽出できたことを確認した。2. プライマー設計アライメント解析後、標的を幅広く設定しプライマー設計したところ、position 190-380領域が最も菌種間で異なる配列を持ち、かつプライマーが作成できるだけの共通領域を保持していたため、候補プライマーを30セット用意した。3. PCR・パイロシークエンスの条件設定および塩基配列の決定と菌種決定DNA抽出の迅速・簡略化を考慮し、KODポリメラーゼを用いたPCR条件設定を行った。M. gordonae以外の菌株でPCRによる標的領域の増幅を認めたが、全ての菌株で標的領域が増幅しなかったため、今後プライマーの再設計とPCR条件設定を更に見直す必要があると思われる。

研究目的 : 非結核性抗酸菌(NTM)の同定には、迅速性に優れた検査法がなく、同定不能になることがしばしばある。本研究では、パイロシークエンス法による迅速かつ正確な抗酸菌同定法の構築を目的とする。研究方法1. 対象菌株と遺伝子抽出 : 当院で保存しているM. bovis BCGおよびATCC株17株(M. kansasii, M. marinum, M. simiae, M. scrofulaceum, M. gordonae, M. szulgai, M. avium, M. intracellulare, M. gastri, M. xenopi, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale, M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus, M. peregrinum)を対象とし、小川培地に発育させた集落をシリカビーズで破砕後、フェノール・クロロフォルム処理、エタノール抽出によりDNAを抽出した。抽出したサンプルは, 16S rRNA遺伝子配列を標的としたプライマーにてPCRを行うことでDNA抽出の確認を行った。2. プライマー設計プライマー設計にはNodaらが報告した抗酸菌59菌種のdnaJ遺伝子配列中、代表的な21菌種の塩基配列を基にDANASISにて比較し、菌種間で最も異なる配列領域を標的として、Pyrosequencing Assay Design Software(QIAGEN)を用いプライマー設計した。3. PCR・パイロシークエンスの条件設定および塩基配列の決定と菌種決定設計したプライマーを用いて、PCR・パイロシークエンス反応の条件を設定した。また、標準菌株の塩基配列をパイロシークエンスにより決定し、得られた配列と遺伝子ライブラリーとの相同性を確認することで菌種決定を評価した。研究結果 1. 遺伝子抽出DNA抽出したサンプルは、16S rRNA遺伝子配列を標的としたPCRにより、全ての菌株で十分量のDNAが抽出できたことを確認した。2. プライマー設計アライメント解析後、標的を幅広く設定しプライマー設計したところ、position 190-380領域が最も菌種間で異なる配列を持ち、かつプライマーが作成できるだけの共通領域を保持していたため、候補プライマーを30セット用意した。3. PCR・パイロシークエンスの条件設定および塩基配列の決定と菌種決定DNA抽出の迅速・簡略化を考慮し、KODポリメラーゼを用いたPCR条件設定を行った。M. gordonae以外の菌株でPCRによる標的領域の増幅を認めたが、全ての菌株で標的領域が増幅しなかったため、今後プライマーの再設計とPCR条件設定を更に見直す必要があると思われる。