ギガアッセイに向けた酵素反応用ナノスペースの構築

千兆酶反应纳米空间的构建

• 批准号: 18656240
• 负责人: 松永 是
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18656240/
• 关键词: ナノスペース; パイロシークエンス; ギガタイタープレート; テロメアーゼ; 酵素; ナノ担体

本研究では、テロメラーゼ酵素活性検出のメガ・ギガレベルでのアッセイ系に向けて、微少領域(ナノスペース)での効率的な酵素反応を実現する手法を確立することを目的とした。この手法では、ナノ担体上に複数種の酵素を集積化し、ある酵素の触媒作用による産物が、別の酵素の触媒作用に必要な物質または基質となるように酵素反応系を設計している。この連鎖触媒作用が近接場で行われることにより、反応効率が向上し、微小領域での高感度アッセイが期待できる。細胞抽出液中のテロメラーゼによって塩基が伸長し、その際に生成されるPPi(ピロリン酸)の検出をパイロシークエンス法に基づいて検出する手法を採用した。まず、PPiの検出に必要な酵素群(ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、及びルシフェラーゼ)をナノ担体上に集積化する方法の検討を行った。化学架橋によりルシフェラーゼ酵素比率を上げることで、PPi検出感度の向上が示された。次にギガタイタープレートを用いたPPi検出に向けたシステム構築を行なった。発光測定装置として,高感度EM-CCDおよび暗箱を用いた。発光検出システムの条件検討には、ミニマイクロタイタープレートを用いた微小領域内でのルシフェラーゼによるATP→発光を高感度に計測した。その結果,Accumulate:50cycles, EM-DAC Level:255,Pixel readout rate:35MHzの場合,300fmol/wellのATP濃度条件化においてルシフェラーゼ由来の発光を検出することが可能であった。この条件下で,各種表面処理剤により表面コーティングをしたギガタイタープレート内での反応およびその発光検出の条件検討を行った。上記実験条件により、微量のテロメラーゼから生産されるPPiを高感度に検出できることが示唆された。

This study で は, テ ロ メ ラ ー ゼ enzyme activity 検 out の メ ガ · ギ ガ レ ベ ル で の ア ッ セ に イ department to け て, small areas (ナ ノ ス ペ ー ス) で の sharper rate な enzyme reverse 応 を be presently す る gimmick を establish す る こ と を purpose と し た. こ の gimmick で は, ナ ノ supporter on に を set product し and plural kinds of の enzyme あ の る enzyme catalysis に よ が る products, don't の の enzyme catalysis に な necessary material ま た は matrix と な る よ う に enzyme reverse 応 を design し て い る. こ の chain catalysis が line nearly meet で わ れ る こ と に よ り, anti 応 が し upward working rate, small area で の Gao Gan degrees ア ッ セ イ が expect で き る. Cellular extract の テ ロ メ ラ ー ゼ に よ っ て salt base が elongation, そ し の interstate に generated さ れ る PPi (ピ ロ リ ン acid) の 検 out を パ イ ロ シ ー ク エ ン ス subgrade に づ い て 検 out す る gimmick を using し た. ま ず, PPi の 検 に な enzymes necessary clusters (ピ ル ビ ン acid リ ン acid ジ キ ナ ー ゼ and び ル シ フ ェ ラ ー ゼ) を ナ ノ supporter に set on product change す る method の 検 line for を っ た. Chemical bridging に よ り ル シ フ ェ ラ ー ゼ enzyme ratio on を げ る こ と で, PPi 検 の が and shown up the sensitivity さ れ た. Time に ギ ガ タ イ タ ー プ レ ー ト を with い た PPi 検 out に to け た シ ス テ ム line build を な っ た. The luminance measurement device と て て, high-sensitivity EM-CCDおよび dark box を for を た. 発 検 out light シ ス テ ム 検 の conditions for に は, ミ ニ マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト を with い た tiny field で の ル シ フ ェ ラ ー ゼ に よ る ATP - 発 light を Gao Gan degrees に measuring し た. Youdaoplaceholder0 そ result,Accumulate:50cycles EM - DAC Level: 255, Pixel readout rate: 35 MHZ の occasions, 300 fmol/well の ATP concentration conditional に お い て ル シ フ ェ ラ ー ゼ origin の 発 light を 検 out す る こ と が may で あ っ た. で こ の conditions, various surface 処 tonic に よ り surface コ ー テ ィ ン グ を し た ギ ガ タ イ タ ー プ レ ー ト within で の anti 応 お よ び そ の 発 light 検 検 の conditions for を row っ た. Written be 験 conditions に よ り, trace の テ ロ メ ラ ー ゼ か ら production さ れ る PPi を Gao Gan degrees に 検 out で き る こ と が in stopping さ れ た.

项目成果

Simultaneous detection of multiple mutations conferring streptomycin resistance inMycobacterium tuberculosis using nanoscale engineered biomagnetites

使用纳米级工程生物磁铁矿同时检测结核分枝杆菌中链霉素耐药性的多个突变

• DOI: 10.1007/bf02697261
• 发表时间: 2006
• 期刊: NanoBiotechnology
• 作者: Kohei Maruyama;Norikuni Uchida;H. Takeyama;Tetsushi Mori;R. Kawaguchi;T. Matsunaga
• 通讯作者: T. Matsunaga

バイオブロセスハンドブック : バイオケミカルエンシニアリングの基礎から有用物質生産・環境調和技術まで(分担執筆 : "微生物によるナノ磁性粒子の生産とバイオ産業への利用"の項を担当)

生物工艺手册：从生化焚烧的基础知识到有用物质的生产和环保技术（合著者：负责“微生物生产纳米磁性颗粒及其在生物工业中的应用”部分）

• 发表时间: 2007
• 作者: 松永 是;吉野知子
• 通讯作者: 吉野知子