ヒトヘルペスウイルス6の前初期蛋白と相互作用する因子の同定と解析

人疱疹病毒6立即早期蛋白相互作用因子的鉴定与分析

基本信息

  • 批准号:
    08770217
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.7万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
  • 财政年份:
    1996
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1996 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

HHVー6B(HST2株)を感染72時間後の末梢血単核球からmRNAを分離し、これを鋳型としてcDNAを合成しpACT2およびpGAD424ベクターに導入してcDNAライブラリーを作製した。これよりIE1cDNAを単離し、ORFの全長をコードするクローンを得た。これから全長(1078aa)をコードするDNA断片をPCRにより作製し、two-hybrid systemのbait発現ベクターpGBT9,pAS2-1にin-frameとなるように挿入した。これらをS.cerevisiae Y190,CG-1945,Y187に導入したところ、形質転換体を得ることができなかった。このことはIE1蛋白の全長が酵母の生存にとってtoxicであることを意味している。そこで、IE1蛋白の様々な領域をカバーする欠失変異体を8種類作製し、上記の酵母に導入したところ、1つを除いて形質転換体を得ることができた。しかし、これらの変異体はそれ単独でリポーター遺伝子を活性化してしまい、baitとして用いることができなかった。これらはいずれも等電点が酸性に偏っており、本来acidic transactivatorとして機能するGAL4のactivation domainの機能を代替してしまった可能性が考えられた。このことからIE1蛋白のアミノ酸配列を詳細に検討したところ、695-1029(335aa)の等電点が7.22であることが判明したため、この領域をbaitとするplasmidを構築して形質転換体を作製した。予想どおり、この株はリポーター遺伝子を活性化せず、baitとして使えることが判明した。そこで、このbaitを含むY190に上述のcDNAライブラリーを導入して、baitと結合する因子のスクリーニングを行った。これまでのところ、2,000,000クローンほど行っているが、ポジティブクローンは同定できていない。平行して行っている別のbaitでは多数のクローンが得られているので、システム自体は動いていると考えられ、baitとして用いたこの領域に問題のある可能性が示唆された。IE1蛋白の全長をGST融合蛋白として大腸菌で発現させ、これをウサギに免疫してポリクローナル抗体を作製した。現在この抗体を用いて生化学的にアプローチすることを検討中である。
HHV 6B (HST2 strain), isolation of mRNA from peripheral blood nuclei after 72 days of infection, and isolation of HHV type 6B cDNA was synthesized by pACT2 pGAD424 and imported into cDNA by pACT2.これよりIE1cDNAを単里し、ORFの全length をコードするクローンを得た.これからFull length(1078aa)をコードするDNA fragmentをPCRによりproducedし, two-hybrid systemのbait発appears pGBT9,pAS2-1にin-frameとなるようにinsertした.これらをS.cerevisiae Y190, CG-1945, Y187に Import したところ, morphological change body をget ることができなかった.このことはIE1proteinのfulllengthがYeastのsurvivalにとってtoxicであることをmeaningしている.そこで, IE1 protein の様々な field をカバーする无変variant を 8 types of production し, The above-mentioned yeast is introduced into the yeast, and the yeast is removed and the shape is changed into a body.しかし、これらの変variant はそれ単多でリポーター伝子を生Sexualized してしまい, bait として Use いることができなかった.これらはいずれもisoelectric point がacidic partial っており、Original acidic transactivator としてfunctional するGAL4 のactivation Domainのfunctionをreplacesしてしまったpossibilityがtestえられた.このことからIE1 protein のアミノacid coordination をDetails に検 Discussion したところ、695-1029 (335aa) のisoelectric point が7 .22 であることが clarification したため、この区をbait とするplasmid をconstruct してmorphological substance 転転 Body を Production した. I want to use it, and I want to use it to activate it, and I want to make it clear.そこで、このbaitをcontains むY190にThe above のcDNAライブラリーを imports して、baitとcombines the するfactor のスクリーニングを行った.これまでのところ、2,000,000クローンほど行っているが、ポジティブクローンは同定できていない. Parallel して行っているbieのbaitでは多のクローンがget られているので、システム自体はThe action is the problem, the possibility is the problem, the possibility is the problem, and the bait is the problem. IE1 protein's full-length GST fusion protein, Escherichia coli, immune system, and immune system antibody are produced. Currently, the antibody is being tested with the にアプローチすることを検 of いてbiochemical.

项目成果

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专著数量(0)
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    5209668
  • 财政年份:
    1999
  • 资助金额:
    $ 0.7万
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  • 批准号:
    09770206
  • 财政年份:
    1997
  • 资助金额:
    $ 0.7万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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