ダイレクトシークエンスおよびサブクローニングによる血液型遺伝子型の解析

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ABO式血液型を決定する糖転移酵素cDNAの261番・297番および703番を含む領域を増幅した.PCR産物のdirect sequencingをDye terminator法とDye primer法を用いて行った.261番においてAA, BB, AB型では単一のGのピークが,00型では完全な欠失が確認された.AO, BO型ではGのピークが重複して観察された.AO, BO型においてはDye primer法の方がDye terminator法よりも正確に判定することができた.297番においてはYamamoto et al.が報告した塩基置換(A遺伝子ではA, B遺伝子ではG)も確認された.また,この部位における塩基置換によりO型をO^AO^A, O^GO^G, O^AO^Gの3種に分けることができた.703番においてはDye terminator法,Dye primer法の両者でAA, AO, OO型では単一のGのピークが,AB, BO型ではGとAのピークが重複して,BB型では単一のAのピークが検出され,容易に判定することができた.現在,AO, BOが容易に識別できるようにprimerの位置を変更するとともに,526番・703番・796番についても検討を続けている.次にPCR産物のpT7Blue T-Vectorヘサブクローニング後のsequencingを試みた.複数個のコロニーを拾い,sequencingを行った所,homozygote, heterozygoteともに正確に型判定が可能であり,混合体液斑痕に有用である可能性が示唆された.ABO式以外にC8型,Duffy型についてPCR-direct sequencingによるタイピングを行ったところ,型判定が容易に可能であった.また,PCR産物のSSCP解析を試みたところ,型判定が可能であった.現在はMN式,GC型のPCR-direct sequencingによるタイピングを検討している.