TPAによる巨核球系細胞への分化誘導における細胞周期制御機構の解析

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1.TPAによるサイクリンE-cdk2複合体キナーゼ活性制御の検討:MEG-01s細胞にTPA添加後、cdk inhibitor (CKI)のうちp21はmRNA、蛋白レベルとも上昇が見られ、これは細胞周期非依存性であった。一方、p27は蛋白質レベルは上昇し、細胞周期依存性にG1期に発現誘導されることが示唆されたが、mRNAレベルに変化はなかった。免疫沈降ウエスタン解析では、TPAで誘導されたこれらCKIはいずれもサイクリンEと共沈し、免疫沈降したサイクリンE複合体のヒストンH1、Rbキナーゼ活性は、ほぼ完全に抑制されていた。以上から、MEG-01sにおけるTPAによる分化誘導に伴う細胞周期停止は、TPAで誘導されたp21とp27がサイクリンE複合体に結合し、そのキナーゼ活性を抑制することによると想定された。その他の巨核球系細胞株の検討では、TPA添加後CMK,Meg-JではサイクリンE蛋白が増加したが、HELではほとんど変化が見られなかった。一方、いずれの細胞株もp21蛋白の発現が誘導され、p27蛋白は構成的な発現が見られ発現レベルに変化はなかった。以上のように、TPAによる細胞周期関連因子の発現は細胞株により異なっていた。2.正常巨核球のTPAによる分化誘導の解析:トロンボポチエン添加により臍帯血由来CD34陽性細胞から巨核球系コロニーを形成し、TPAを添加すると、CD41発現増強は見られるものの、サイクリンE、p21の発現増強は検出できなかった。p21のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて分化誘導の阻害を試みることとし、MEG-01sを用いて至適条件の検討を行なっている。MEG-01sで見られる現象が、正常巨核球で見られるかどうかさらに検討する予定である。endomitosisにおける細胞周期制御は本年度は見るべき成果が得られなかった。