ヒト・リコンビナント・リンフォトキシンβの作製とモノクローナル抗体株の確立

人重组β淋巴毒素的生产及单克隆抗体株的建立

• 批准号: 08770929
• 负责人: 中田 達広
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770929/
• 关键词: リンフォトキシンβ; リコンビナント蛋白; pETベクター; 抗リンフォトキシンβ抗体

健常人末梢血からリンパ球を分離しリコンビナント・インターロイキン2(IL-2)を添加培養し、LAK細胞を作製した。LAK細胞からmRNAを抽出し、さらにcDNAを合成した。そのcDNAをテンプレートとして、この実験のためにデータベースから設計したプライマーを用いて、PCR法によりリンフォトキシンβ(LT-β)のcDNAを増幅した。得られたLT-βのcDNAを制限酵素にて処理したのち、スピンカラムで処理し同制限酵素で処理したpET29b(+)ベクターにライゲーションさせた。得られたベクターにて大腸菌株JM109をトランスフォーメーションさせ、純粋なLT-βのcDNAインサートを有するベクターを精製した。そのベクターを用いて蛋白発現用大腸菌株BL21(DE3)をトランスフォーメーションさせた。同菌株をプレートに培養しコロニーを得た後、PCR法にてインサートの有無をスクリーニングし数種の株を得た。それらの株を培養後IPTGにて蛋白発現を誘導させ、SDS-PAGE法にて電気泳動し、PVDF膜に電気的に転写させた後、ベクターの有する蛋白産物特異的シーケンスを利用した染色を行い最終的に1株を得た。その大腸菌株を大量培養しIPTGで蛋白発現を誘導させた後、菌体を遠心した。誘導蛋白は封入体中に含有されていたため、菌体を尿素とグアニジウムにて可溶化させた後、カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、純粋なヒト・リコンビナントLT-β蛋白を大量に得た。得られた蛋白を家兎に免疫し、ポリクローナル抗体を作製した。また、同蛋白をマウスに免疫し常法にてモノクローナル抗体の作製を試みているが現在までのところその作製には成功していない。今後もモノクローナル抗体の作製を引き続き行うとともに、得られたLT-β蛋白と抗LT-β家兎ポリクローナル抗体を用いてLAK細胞の抗腫瘍活性の解析や、その他細胞でのLT-β発現の検討を行う。

In normal people, the peripheral blood samples are separated from each other, the balls are separated from each other, and the cells of LAK cells are added to the culture of normal people (IL-2), and the cells of LAK are added to make the test. LAK, mRNA, extract, cDNA, synthesize. In this paper, we use the cDNA method to determine the size of the device, and the PCR method to determine the size of the cDNA image of β (LT- β). The restriction enzyme pET29b (+), enzyme restriction enzyme pET29b (+), enzyme restriction enzyme, enzyme restriction, enzyme restriction, enzyme restriction, The strains of JM109, β-cDNAs, JM109, β-cDNAs, cDNAs, cDNAs and sperm were detected. The strain BL21 (DE3) was used in the laboratory and the protein was used in the laboratory. After the same strain was successfully cultured, several strains were successfully tested by PCR method. After incubation, the IPTG protein was detected by Elisa, SDS-PAGE electrophoresis assay, PVDF membrane electrophoretic assay (Elisa), and the enzyme assay was used to detect the most sensitive strain in the culture line. After a large number of IPTG proteins were cultured in a large number of strains, the bacteria were isolated from the bacteria after induction. The lead protein encapsulated body contains a large amount of LT-β protein, and the cell contains a large amount of LT-β protein after it is dissolved in urea. The protein was immunized, the antibody was immunized and the antibody was used. The same protein was used in the immune system, and the usual method was used to detect the antibody. Now, the antibody was successfully tested. In the future, LT- β protein, anti LT- β, anti β protein, anti β protein, anti β protein,