培養エナメル芽細胞の分化段階を明らかにする特異的細胞分化マーカーの探索

寻找明确培养成釉细胞分化阶段的特异性细胞分化标记物

• 批准号: 08771571
• 负责人: 田畑 純
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08771571/
• 关键词: エナメル芽細胞; 分化マーカー; 増殖・分化の制御; HGFレセプター・c-Met; ケラチン14(K14); アメロジェニン(En3)

当申請者のグループでは数年前からエナメル芽細胞の初代培養方法を無血清培地を用いて開発しつつ、その培養条件下における細胞の生理的特性や分化状態を研究している。これらの成果として、培養下においてエナメル芽細胞は、1.もっとも分裂活性が高い遊走段階、2.分裂活性が低く、遊走細胞が集合することで形成するクラスター形成段階、3.分裂停止し、エナメル基質産生を開始する背の高い細胞段階、という分化を示すことが判明している。本研究では、まず、培養エナメル芽細胞の分化段階を形態に頼らず判定できるようにするための分化マーカー探索を行う。分化マーカーは、既知の因子でモノクローナル抗体がすでに作製されているものを候補とし、vivoとvitroの両方で時期特異的に発現する分子を認識できる抗体を探索することにした。そこで、1.上皮-間葉の相互作用に働くことが予想されるHGF,EGF KGFなどの因子およびそのレセプター、2.皮膚角化上皮で既によく知られているケラチンなどの分化マーカー、3.エナメル質形成および石灰化に働くと考えられているアメロジェニン、アルカリフォスファターゼなどを認識する抗体、計31種を候補とし、ラット新生仔の下顎を用いて新鮮凍結切片を作製し、スライドグラス上で固定後、免疫組織染色を行って観察した。また、生後7日齢ラットの切歯唇側からエナメル芽細胞を調整し、コラーゲンプレートに蒔きこみ、培養2日目、4日目、7日目で固定し免疫細胞染色に用いてin vitroでの観察を行った。その結果、HGFレセプター(c-Met)、ケラチン14(K14)、アメロジェニン(En3)をマーカーとした時、その陽性反応が形態からの分類と一致し、要求を満たす分化マーカーとして好適であることが判明した。すなわち、1.遊走細胞は、c-Met(+),K14(-)、En3(-) 2.クラスター細胞は、c-Met(+),K14(+)、En3(-) 3.背の高い細胞は、c-Met(+),K14(+)、En3(+)と段階を追って陽性の細胞が現れた。この基準はvivoでの免疫染色の結果とも矛盾せず、これらマーカーの使用により、初代培養系で見られる3段階の細胞が、vivoにおける内エナメル上皮細胞、前エナメル芽細胞、エナメル芽細胞に相当することが判明した。本研究の主な成果は、第101回日本解剖学会全国学術集会と、Arch.Oral Biologyにて発表した。

When the applicant's cell culture began several years ago, the method of primary culture of germinal cells was developed in serum-free culture, and the physiological characteristics and differentiation status of cells were studied under the culture conditions. 1. The mitotic activity is high in the middle of the migration stage; 2. The mitotic activity is low in the middle of the migration stage; 3. The mitotic activity stops; 4. The matrix production begins; 5. The differentiation stage is high in the middle of the differentiation stage. In this study, the differentiation stage, morphology and differentiation of cultured germ cells were determined and explored. The differentiation factor is known as the antibody, and the candidate, vivo and vitro are known as the antibody. 1. Epithelial-mesenchymal interaction: HGF,EGF, KGF, K Fresh frozen sections of newborn mandibles were prepared, fixed, and examined by immunohistochemical staining. After 7 days of life, the cells were cultured for 2 days, 4 days and 7 days, and fixed for immunocyte staining. The results of HGF, C-Met, C-K-14, C-K-3, C-K-14, C-K-14, C-K 1. Wandering cells, c-Met(+),K14(-), En3 (-) 2. Squeeze cells, c-Met(+),K14(+), En3 (-) 3. Backward cells, c-Met(+),K14(+), En3 (+) and positive cells are present. The results of immunostaining in vivo were inconsistent with those in vivo, and the results of immunostaining in vivo were consistent with those in primary culture lines. The main results of this study were presented at the 101st National Symposium of the Japanese Anatomical Society, Arch.Oral Biology.

项目成果

Tabata et al.: "Hepatocyte growth factor is involved in the morphogenesis of tooth germ in murine molars." Development. 122. 1243-1251 (1996)

Tabata 等人：“肝细胞生长因子参与小鼠磨牙牙胚的形态发生。”

Liu,Tabata et al.: "Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) is essential in the development murine molars." 10th International Congress of Histochemistry and Cytochemistry. (1996)

Liu, Tabata 等人：“甲状旁腺激素相关肽 (PTHrP) 对于小鼠磨牙的发育至关重要。”

柴口・加藤・田畑 他: "LIM-homeodomain遺伝子L3の歯胚における発現." 第101回日本解剖学会全国学術集会. (1996)

Shibaguchi、Kato、Tabata 等人：“牙胚中 LIM-同源域基因 L3 的表达”，日本解剖学会第 101 届全国科学会议（1996 年）。

Tabata et al.: "Expression of cytokeratin 14 in ameloblast-lineage cells of the developing tooth of rat both in vivo and in vitro." Archives of oral Biology. (in press). (1996)

Tabata 等人：“体内和体外大鼠发育牙齿的成釉细胞谱系细胞中细胞角蛋白 14 的表达。”

田畑純 他: "歯胚の上皮・間葉細胞を特異的に認識する抗体の探索." 第101回日本解剖学会全国学術集会. (1996)

Jun Tabata 等人：“寻找特异性识别牙胚上皮细胞和间充质细胞的抗体。”日本解剖学会第 101 届全国学术会议（1996 年）。