リンパ球によるアセチルコリン合成と合成酵素の遺伝子解析

淋巴细胞乙酰胆碱合成和合成酶的遗传分析

基本信息

  • 批准号:
    08772104
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.64万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
  • 财政年份:
    1996
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1996 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

1)コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)mRNAを発現する血球細胞種の特定T細胞系細胞株7種(CEM,HSB-2,HPB-ALL,Jurkat,MOLT-3,MOLT-4,HUT-78)、B細胞系細胞株4種(NALM-1,Daudi,KOPN-8,NALM-6)およびリンパ系前駆細胞株2種(NALM-16,REH)を用いた。各細胞株よりpoly(A)^+RNAを抽出し、ヒト脳ChAT遺伝子の配列の一部をプライマーとして逆転写-polymerase chain reaction(PCR)を行なった。ChAT mRNAの発現は、T細胞系細胞株にのみ認められ、B細胞系細胞株およびリンパ系前駆細胞株には認められなかった。各細胞株中のアセチルコリン(ACh)含量は、ChAT mRNA発現の有無と相関していた。以上より、血球細胞のうちT細胞のみがChAT mRNAを発現していることが明らかとなった。2)ChAT mRNAのノーザンブロット解析最もACh合成能が高いMOLT-3より調製したpoly(A)^+RNA用いて、ChAT mRNA発現量およびサイズをノーザンブロット解析した。^<32>p放射ラベルしたChAT特異的cDNAプローブをハイブリダイズさせ、オートラジオグラムをとった。しかしながら、ChAT mRNAは検出できなかった。ChAT mRNA発現量が脳と比較して非常に少ないことが考えられる。予備実験で半定量的-PCRを行い、リンパ球では脳と比較して少くとも1000分の1以下のChAT mRNA発現量であることを確認した。このことは、リンパ球のChAT活性が、脳で最もChAT活性の高い線条体の1000分の1程度であることに一致する。3)ChAT全塩基配列の解析脳ChATの塩基配列より作製したPCRプライマーを用いて、T細胞中のChAT mRNAを増幅した。しかしながら、発現量はが低いためクローニングに十分なcDNAを得られず、本年度中の全塩基配列決定は実現できなかった。引き続きPCR条件などのクローニング戦略を再検討した上で実施予定である。
1) コ リ ン ア セ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (ChAT) mRNA を 発 now す る kind の specific T cell line cell lines 7 kinds of blood cells (CEM, HSB - 2, HPB - ALL, Jurkat, MOLT, MOLT - 4, HUT - 78), B cell line cell line 4 (NALM - 1, Daudi Two pre-駆 cell lines (NALM-16,REH) of the KOPN-8,NALM-6 およびリ パ パ line (nalm-16, reh)を use た た. Each cell lines よ り poly real ^ (A) + RNA を drew し, ヒ ト 脳 ChAT heritage 伝 の match sequence の A を プ ラ イ マ ー と し て inverse planning write - polymerase chain reaction (PCR) line を な っ た. ChAT mRNA の 発 は now, T cell line cell lines に の み recognize め ら れ, B cell line cell lines お よ び リ ン パ department before 駆 cell lines に は recognize め ら れ な か っ た. In each cell line, there is a と correlation between the content of <s:1> アセチ アセチ コリ コリ コリ (ACh) and the occurrence of ChAT mRNA, and the <s:1> て た た た た. The above よ り, blood cell の う ち t-cell の み が ChAT mRNA を 発 now し て い る こ と が Ming ら か と な っ た. 2) ChAT mRNA の ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト parsing the も ACh synthesis can が high い MOLT - 3 よ り modulation し た poly real ^ (A) + RNA with い て, ChAT mRNA 発 now quantity お よ び サ イ ズ を ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト parsing し た. ^ < > 32 p radiation ラ ベ ル し た ChAT specific cDNA プ ロ ー ブ を ハ イ ブ リ ダ イ ズ さ せ, オ ー ト ラ ジ オ グ ラ ム を と っ た. <s:1> ながら, ChAT mRNA 検 検 from で な な った った った った った った. The occurrence of ChAT mRNA is が脳と compared to that of て, which is very に low, な, えられる, とが and えられる. Reserve be 験 で - of semi-quantitative PCR を い, リ ン パ ball で は 脳 と compare し て less く と も below 1000 points の 1 の ChAT mRNA 発 now quantity で あ る こ と を confirm し た. こ の こ と は, リ ン パ ball の が ChAT activity, 脳 で most も ChAT activity の い line body の 1000 points higher の 1 degree で あ る こ と に consistent す る. 3) ChAT all salt base with column の parsing 脳 ChAT の salt column base with よ り cropping し た PCR プ ラ イ マ ー を with い て, T cells の ChAT mRNA を rights of し た. し か し な が ら, 発 now は が low い た め ク ロ ー ニ ン グ に very な cDNA を have ら れ ず, this annual の salt base full column decided は be presently で き な か っ た. Lead き 続 き PCR conditions な ど の ク ロ ー ニ ン グ 戦 slightly を again beg し 検 た で on be to decide で あ る.

项目成果

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