アフィニティープローブを用いたアシルCoAの新規標的蛋白質の検索と生理作用の解明

使用亲和探针寻找酰基辅酶A的新靶蛋白并阐明其生理效应

基本信息

批准号：
08772110
负责人：
山下純
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Teikyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1、アシルCoAの標的(結合)蛋白質の検出、精製アシルCoAと結合する蛋白質を検索するために、アシルCoAの脂肪酸部分に光感受性基を導入したフォントアフィニティープローブを合成した。検出を容易にするため、125Iで標識した。蛋白質とフォトアフィニティプローブをインキュベートした後、UVを照射し、SDS電気泳動後にオートラジオグラフィーで検出すると、ラット肝臓ミクロソームに数種類のアシルCoA結合性蛋白質を検出できた。これらのなかでひとつを精製した。精製蛋白質のアミノ酸配列を検討すると、薬物や脂溶性内因性物質をグルクロン酸抱合するUDPグルクロン酸転移酵素であることが明らかとなった。本研究により、UDPグルクロン酸転移酵素がアシルCoA結合性蛋白質であること示された。2、UDPグルクロン酸転移酵素のアシルCoA結合活性の解析UDPグルクロン酸転移酵素のアシルCoA結合活性のKinetics、アシルCoAの構造活性相関などを詳細に実験した。アシルCoA結合のKd値はおよそ10μMであり、Bmax価はおよそ1mol/mol proteinであった。アシルCoA結合は、アシルCoAに特異的で、CoA部分の3'ーリン酸を除いたアシルデホスホCoAには結合活性は無かった。この蛋白質がCoA部分を厳密に認識していることが考えられた。しかし、脂肪酸部分の特異性は比較的ゆるく、脂肪酸アナログであるアジドサリチルアミドドデカン酸をもつアシルCoAにも結合活性があった。3、UDPグルクロン酸転移酵素のアシルCoA結合の生理的な意義UDPグルクロン酸転移酵素活性がアシルCoA結合により阻害されることをみいだした。今までにUDPグルクロン酸転移酵素活性を活性化あるいは阻害する化合物などは知られていなかったが、アシルCoAは初めて見いだされた阻害物質である。細胞内のアシルCoAの変動により、UDPグルクロン酸転移酵素活性が調節される可能性が考えられた。

1。检测靶（结合）蛋白的酰基-COA并搜索与纯化的酰基辅酶A结合的蛋白，将光敏基团引入酰基-COA的脂肪酸部分中的字体亲和力探针被合成。为了促进检测，它被标记为125i。在孵育蛋白质和光性探针后，用紫外线照射该蛋白质并在SDS电泳后通过放射自显影检测，可以在大鼠肝微粒体中检测到几种类型的酰基-COA结合蛋白。其中之一被纯化。在检查纯化蛋白质的氨基酸序列时，发现它是一个UDP葡萄糖醛酸转移酶，可将药物和脂溶性内源性物质结合。这项研究表明，UDP葡萄糖醛酸酶是一种酰基-COA结合蛋白。 2。分析UDP葡萄糖酶的酰基-COA结合活性，我们对UDP葡萄糖酶的酰基-COA结合活性的动力学进行了详细的实验以及酰基-COA的结构活性关系。酰基-COA键的KD值约为10μM，BMAX值约为1 mol/mol蛋白。酰基-COA结合特异性对于酰基-COA，除了COA部分中的3'-磷酸外，与酰基二磷的结合没有结合活性。据认为，该蛋白质密切认识到COA部分。然而，脂肪酸部分的特异性相对较松，酰基辅酶A的酰基辅酶A具有脂肪酸类似物氮化叶酸十二烷酸，也具有结合活性。 3。UDP葡萄糖醛酸酶的酰基-COA结合的生理意义，我们发现UDP葡萄糖醛酸酶的活性被酰基-COA结合抑制。到目前为止，尚未知道激活或抑制UDP葡萄糖酶活性的化合物，但酰基-COA是第一个发现的抑制剂。据认为，细胞内酰基辅酶A的变化可能调节UDP葡萄糖醛酸糖酸酯转移酶活性。