アフィニティープローブを用いたアシルCoAの新規標的蛋白質の検索と生理作用の解明

使用亲和探针寻找酰基辅酶A的新靶蛋白并阐明其生理效应

• 批准号: 08772110
• 负责人: 山下 純
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Teikyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08772110/
• 关键词: アシルCoA; フォトアフィニティープローブ; UDPグルクロン酸転移酵素; CoA; 脂肪酸アナログ; 阻害

1、アシルCoAの標的(結合)蛋白質の検出、精製アシルCoAと結合する蛋白質を検索するために、アシルCoAの脂肪酸部分に光感受性基を導入したフォントアフィニティープローブを合成した。検出を容易にするため、125Iで標識した。蛋白質とフォトアフィニティプローブをインキュベートした後、UVを照射し、SDS電気泳動後にオートラジオグラフィーで検出すると、ラット肝臓ミクロソームに数種類のアシルCoA結合性蛋白質を検出できた。これらのなかでひとつを精製した。精製蛋白質のアミノ酸配列を検討すると、薬物や脂溶性内因性物質をグルクロン酸抱合するUDPグルクロン酸転移酵素であることが明らかとなった。本研究により、UDPグルクロン酸転移酵素がアシルCoA結合性蛋白質であること示された。2、UDPグルクロン酸転移酵素のアシルCoA結合活性の解析UDPグルクロン酸転移酵素のアシルCoA結合活性のKinetics、アシルCoAの構造活性相関などを詳細に実験した。アシルCoA結合のKd値はおよそ10μMであり、Bmax価はおよそ1mol/mol proteinであった。アシルCoA結合は、アシルCoAに特異的で、CoA部分の3'ーリン酸を除いたアシルデホスホCoAには結合活性は無かった。この蛋白質がCoA部分を厳密に認識していることが考えられた。しかし、脂肪酸部分の特異性は比較的ゆるく、脂肪酸アナログであるアジドサリチルアミドドデカン酸をもつアシルCoAにも結合活性があった。3、UDPグルクロン酸転移酵素のアシルCoA結合の生理的な意義UDPグルクロン酸転移酵素活性がアシルCoA結合により阻害されることをみいだした。今までにUDPグルクロン酸転移酵素活性を活性化あるいは阻害する化合物などは知られていなかったが、アシルCoAは初めて見いだされた阻害物質である。細胞内のアシルCoAの変動により、UDPグルクロン酸転移酵素活性が調節される可能性が考えられた。

1, ア シ ル CoA の mark (combination) protein の 検, refined ア シ ル CoA と combining す る protein を 検 cable す る た め に, ア シ ル CoA の fatty acid part に light sensitivity matrix を import し た フ ォ ン ト ア フ ィ ニ テ ィ ー プ ロ ー ブ を synthetic し た. Youdaoplaceholder0 is prone to を, and 125Iで is marked as た. Protein と フ ォ ト ア フ ィ ニ テ ィ プ ロ ー ブ を イ ン キ ュ ベ ー ト し た, UV し を exposure after bathing, SDS electric 気 に after オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー で 検 out す る と, ラ ッ ト routine liver ミ ク ロ ソ ー ム に several kinds の ア シ ル CoA associativity protein を 検 out で き た. Youdaoplaceholder2 れら な な でひと を を を refined た た. Refined protein の ア ミ ノ acid with column を beg す 検 る と, 薬 や fat-soluble endogenous substance を グ ル ク ロ ン acid looping す る UDP グ ル ク ロ ン acid planning shift enzyme で あ る こ と が Ming ら か と な っ た. In this study, によ グ, UDPグ, グ, ロ, <s:1> acid 転, enzyme がアシ, がアシ, CoA binding protein である, である, と showed された. 2, UDP グ ル ク ロ ン acid planning shift enzyme の ア シ ル CoA binding activity の parsing UDP グ ル ク ロ ン acid planning shift enzyme の ア シ ル CoA binding activity の Kinetics, ア シ ル CoA の tectonic active phase masato な ど を detailed に be 験 し た. ア シ ル CoA combining の Kd numerical は お よ そ 10 microns で あ り, Bmax 価 は お よ そ 1 mol/mol, protein で あ っ た. ア シ ル CoA は, ア シ ル CoA に specific で, CoA の 3 'ー リ ン acid を except い た ア シ ル デ ホ ス ホ CoA に は binding activity は no か っ た. <s:1> <s:1> protein がCoA part を厳 secret に understanding <s:1> て る る とが とが study えられた. し か し, fatty acid part の specificity は comparison ゆ る く, fatty acid ア ナ ロ グ で あ る ア ジ ド サ リ チ ル ア ミ ド ド デ カ ン acid を も つ ア シ ル CoA に も binding activity が あ っ た. 3, UDP グ ル ク ロ ン acid planning shift enzyme の ア シ ル CoA な significance of combining の physiological UDP グ ル ク ロ ン acid planning shift enzyme activity が ア シ ル CoA combining に よ り resistance against さ れ る こ と を み い だ し た. This ま で に UDP グ ル ク ロ ン acid planning shift enzyme activity を activeness あ る い は resistance against す る compound な ど は know ら れ て い な か っ た が, ア シ ル CoA は early め て see い だ さ れ た resistance against material で あ る. Intracellular の ア シ ル CoA の - move に よ り, UDP グ ル ク ロ ン acid が planning shift enzyme activity regulating さ れ る possibility が exam え ら れ た.

项目成果

Takayuki Sugiura et al.: "Coenzyme A-dependent cleavage of membrane phospholipids in several rat tissues : ATP-independent acyl-CoA synthesis and the generation of lysophospholipids" Biochim.Biophys.Acta.1255. 167-176 (1995)

Takayuki Sugiura 等人：“几种大鼠组织中膜磷脂的辅酶 A 依赖性裂解：ATP 独立的酰基辅酶 A 合成和溶血磷脂的生成”Biochim.Biophys.Acta.1255。

Takayuki Sugiura et al.: "Transacylase-and phosphodiesterase-mediated synthesis of anadamide (N-arachidonoyl ethanolamine),an endogenous cannabinoid receptor ligand,in rat brain microsomes" European J.Biochem.240. 53-62 (1996)

Takayuki Sugiura 等人：“大鼠脑微粒体中内源性大麻素受体配体 anadamide（N-花生四烯酰乙醇胺）的转酰基酶和磷酸二酯酶介导的合成”European J.Biochem.240。

Atsushi Yamashita et al.: "Acyl-CoA binding and acylation of UDP-glucuronosyltransferase isoforms of rat liver : their effect on enzyme activity" Biochem.J.312. 301-308 (1995)

Atsushi Yamashita 等人：“大鼠肝脏 UDP-葡萄糖醛酸基转移酶亚型的酰基辅酶 A 结合和酰化：它们对酶活性的影响”Biochem.J.312。

Atsushi Yamashita et al.: "Inhibition of UDP-glucuronosyltransferase activity by fatty acyl-CoA : Kinetic study and structure-activity relationship" Biochem.Pharmacol.(in press). (1996)

Atsushi Yamashita 等人：“脂酰辅酶 A 抑制 UDP-葡萄糖醛酸基转移酶活性：动力学研究和结构-活性关系”Biochem.Pharmacol.（出版中）。

Takayuki Sugiura et al.: "2-Arachidonoylglycerol,a putative endogenous cannabinoid receptor ligand,induces repid,transient elevation of intracellular free Ca in NG108-15 cells" Biochem.Biophys.Res.Commun.229. 58-64 (1996)

Takayuki Sugiura 等人：“2-Arachidonoylglycerol，一种推定的内源性大麻素受体配体，在 NG108-15 细胞中诱导细胞内游离 Ca 的快速、短暂升高”Biochem.Biophys.Res.Commun.229。