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イネ2本鎖RNAの複製機構の解析及びその植物RNAベクターへの応用

水稻双链RNA复制机制分析及其在植物RNA载体中的应用

基本信息

批准号：
09740592
负责人：
福原敏行
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

イネ2本鎖RNAの複数機構を研究するため、イネ懸濁培養細胞よりマイクロソーム画分を調整し、2本鎖RNAの複製酵素活性を[α-32P]UTPの取り込み活性を指標に解析した結果、2本鎖RNAを保持する細胞のマイクロソーム画分には特異的な取り込み活性が検出された。この反応産物を電気泳動により同定した結果、イネ二本鎖RNAの分子量と同じ約14kbの位置に優先的な取り込み産物が観察され、経時的にその取り込みが増加した。ノーザンハイブリダイゼーション解析より、この反応産物は、イネ2本鎖RNA中にコードされているRNA依存RNA合成酵素(RdRp)による複製産物である事が示された。このRdRp活性は、マグネシウムおよびヌクレオチド三リン酸要求性であり、アクチノマイシンDやαアマニチンといったDNA依存RNA合成酵素の阻害剤に非感受性であった。Protease Kとデオキシコール酸を用いた実験からは2本鎖RNAの複製複合体が、ベクシル状の膜に包まれている事が示唆された。また細胞内でプラス鎖同士がランダムに繋がった分子が存在していることが明らかとなった。この分子はin vitroの複製反応において急激に増加したことから、イネ内在性2本鎖RNAの複製反応に関与する中間産物であると推測された。界面活性剤によるマイクロソーム画分からのRdRpの可溶化と、グリセロール密度勾配分画を行うことによりさらにRdRpを精製し、外から加えたRNAを鋳型としてin vitro複製反応を行った。その結果、精製した2本鎖RNAが複製に必須な因子との結合能を持つものの、複製に対しては不活性であり、複製活性を持つのは一本鎖のRNA分子であることが示唆された。さらに、マイナス鎖の3'末端、約410bの配列中にプラス鎖合成の際の複製必須領域が含まれている事が示唆された。以上、本年度は、RdRpの諸性質や複製必須流域が明らかとなるなど、イネ2本鎖RNAの植物RNAベクター応用にむけ十分な成果が得られた。

イネ2 lock RNA's plural mechanism research するため, イネsuspended culture cell よりマイクロソームdrawing and adjustment を, 2 lock RNA's replication enzyme activity を [α-32 P] UTP のGET り込みを index に ANALYSIS した results, 2 lock RNA を KEEP する cell のマイクロソーム draw には specific なGET り込み ACTIVITY 検出された. The reaction product is the same as the electrophoresis result, and the molecular weight of the double lock RNA is about 1 4kb position priority is given to the product of the 4kb position, the product of the 4kb position, and the priority of the 4kb position.ノーザンハイブリダイゼーション analysis より, このreaction product は, イネ2 lock RNA in にコードされているRNA-dependent RNA synthesis enzyme (RdRp) and the replication product である事がshow された.このRdRp active は、マグネシウムおよびヌクレオチド三リン acid requirement であり、アクチノマイシンDやαアマニチンといったDNA-dependent RNA synthesis enzyme is a blocking agent that is not sensitive to であった. Protease Kとデオキシコール acid を Use いた実験からは2 this lock RNA の complex The composite material is made of composite material, and the ベククシル-shaped film is wrapped in a stylus. The intracellular でプラス lock がランダムに system がったmolecules exist していることが明らかとなった.このmolecule は in vitro のreplication reaction において速に嗗たことから、イネ internality 2 The replication reaction に of RNA lock and する intermediate product であると speculate された. Interface active material Distribution of painting を row うことによりさらに Rd Rp を refined し, outside から plus えた RNA 鋳 type としてin in vitro copy reaction を行った.そのresult, refined した2 original lock RNA がreplication にな factor とのbinding energy をhold つものの, replication に対しては inactive であり, replication active をhold つのは a lock of RNA molecules であることがshows instigation された.さらに, マイナス丝の3' end, about 410b of arrangement in the にプラス lock synthesized のinterior の copy required area が有まれている事が说円された. Above, this year's は, RdRp の various properties must be copied in the watershed が明らかとなるなど, イネ2 this lock RNA の plant RNA ベクター応にむけ十な results がget られた.