イネ2本鎖RNAの複製機構の解析及びその植物RNAベクターへの応用

水稻双链RNA复制机制分析及其在植物RNA载体中的应用

• 批准号: 09740592
• 负责人: 福原 敏行
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09740592/
• 关键词: 2本鎖RNA; イネ; RNA依存RNA合成酵素; ベクター; 複製酵素; マイクロソーム画分; 複製必須領域; アクチノマイシンD; 野生イネ; コピー数制御; ニック

イネ2本鎖RNAの複数機構を研究するため、イネ懸濁培養細胞よりマイクロソーム画分を調整し、2本鎖RNAの複製酵素活性を[α-32P]UTPの取り込み活性を指標に解析した結果、2本鎖RNAを保持する細胞のマイクロソーム画分には特異的な取り込み活性が検出された。この反応産物を電気泳動により同定した結果、イネ二本鎖RNAの分子量と同じ約14kbの位置に優先的な取り込み産物が観察され、経時的にその取り込みが増加した。ノーザンハイブリダイゼーション解析より、この反応産物は、イネ2本鎖RNA中にコードされているRNA依存RNA合成酵素(RdRp)による複製産物である事が示された。このRdRp活性は、マグネシウムおよびヌクレオチド三リン酸要求性であり、アクチノマイシンDやαアマニチンといったDNA依存RNA合成酵素の阻害剤に非感受性であった。Protease Kとデオキシコール酸を用いた実験からは2本鎖RNAの複製複合体が、ベクシル状の膜に包まれている事が示唆された。また細胞内でプラス鎖同士がランダムに繋がった分子が存在していることが明らかとなった。この分子はin vitroの複製反応において急激に増加したことから、イネ内在性2本鎖RNAの複製反応に関与する中間産物であると推測された。界面活性剤によるマイクロソーム画分からのRdRpの可溶化と、グリセロール密度勾配分画を行うことによりさらにRdRpを精製し、外から加えたRNAを鋳型としてin vitro複製反応を行った。その結果、精製した2本鎖RNAが複製に必須な因子との結合能を持つものの、複製に対しては不活性であり、複製活性を持つのは一本鎖のRNA分子であることが示唆された。さらに、マイナス鎖の3'末端、約410bの配列中にプラス鎖合成の際の複製必須領域が含まれている事が示唆された。以上、本年度は、RdRpの諸性質や複製必須流域が明らかとなるなど、イネ2本鎖RNAの植物RNAベクター応用にむけ十分な成果が得られた。

イ ネ 2 this lock RNA の plural institution を research す る た め, イ ネ clouding culture cell よ り マ イ ク ロ ソ ー ム draw points を adjustment し 2 の this lock RNA replication and enzyme activity を UTP の alpha 32 p took り 込 を み activity index に parsing し た results, 2 the lock RNA を keep す る cells の マ イ ク ロ ソ ー ム draw points に は specific な take り 込 み The activity が検 gives out された. こ の anti 応 product を electric 気 swimming に よ り with fixed し た results, イ ネ 2 lock RNA の と molecular weight with じ about 14 KB の position に な take priority り 込 み product が 観 examine さ れ and 経 に そ の take り 込 み が raised plus し た. ノ ー ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン parsing よ り, こ の は 応 products, イ ネ 2 this lock RNA に コ ー ド さ れ て い る RNA dependent RNA synthesis enzyme (RdRp) に よ る copy product で あ が る things in さ れ た. こ の RdRp activity は, マ グ ネ シ ウ ム お よ び ヌ ク レ オ チ ド three リ ン acid sex で あ り, ア ク チ ノ マ イ シ ン D や alpha ア マ ニ チ ン と い っ た DNA dependent RNA synthesis enzyme の resistance against tonic に the susceptibility で あ っ た. Protease K と デ オ キ シ コ ー を ル acid with い た be 験 か ら は の 2 this lock RNA replication complex が, ベ ク シ ル shape の membrane に package ま れ て い が る things in business さ れ た. ま た intracellular で プ ラ ス lock with James が ラ ン ダ ム に 繋 が っ が た molecules exist し て い る こ と が Ming ら か と な っ た. は こ の molecules in vitro の copy the 応 に お い て nasty shock に raised plus し た こ と か ら, イ ネ の internality 2 this lock RNA replication anti 応 に masato and す る intermediate で あ る と speculation さ れ た. Interfacial activity tonic に よ る マ イ ク ロ ソ ー ム draw points か ら の RdRp の solubilization と, グ リ セ ロ ー ル density hook line partition painting を う こ と に よ り さ ら に RdRp を refined し, outside か ら plus え た RNA を type where と し て in vitro replication anti 応 を line っ た. そ の results, refined し が た 2 this lock RNA replication に must な factor と の binding energy を hold つ も の の, duplicate に し seaborne て は not active で あ り, replication activity を つ の は a lock の RNA molecules で あ る こ と が in stopping さ れ た. さ ら に, マ イ ナ ス の lock 3 'end, about 410 b の match column に プ ラ ス lock synthetic の interstate の が copy must field containing ま れ て い が る things in business さ れ た. All the above, this year's は, RdRp の nature や copy must specify the ら basin が か と な る な ど, イ ネ の plant 2 this lock RNA RNA ベ ク タ ー 応 with に む け very が な achievements have ら れ た.

项目成果

Toshiyuki Fukuhara: "Double-Stranded RNA in Rice" Journal of Plant Research. (印刷中).

Toshiyuki Fukuhara：“水稻中的双链 RNA”植物研究杂志（正在出版）。

Toshiyuki Fukuhara: "Expression of Vpl and water channel proteins during seed germination" Plant & Cell Environment. (印刷中).

Toshiyuki Fukuhara：“种子萌发过程中 Vpl 和水通道蛋白的表达”《植物与细胞环境》（正在出版）。

Ryuichi Koga: "Molecular characterization of a single mitochondrial-associated double-stranded RNA in the green alga Bryopsis" Plant Molecular Biology. (印刷中). (1998)

Ryuichi Koga：“绿藻羽藻中单个线粒体相关双链 RNA 的分子特征”植物分子生物学（1998 年出版）。

Ryuichi Koga: "Origin and evolution of endogenous double-stranded RNA in plants" Viva Origino. 26. 229-240 (1998)

Ryuichi Koga：“植物内源双链 RNA 的起源和进化”Viva Origino。

Hiromitsu Moriyama: "Unusual inheritance of evolutionarily-related double-stranded RNAs in interspecific hybrid between rice plants Oryza sativa and Oryza rufipogon." Plant Molecular Biology. (印刷中).

Hiromitsu Moriyama：“水稻植物 Oryza sativa 和 Oryza rufipogon 之间与进化相关的双链 RNA 的异常遗传。”（正在出版）。