植物の新規な遺伝子ベクターの開発

新型植物基因载体的开发

• 批准号: 14656127
• 负责人: 福原 敏行
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14656127/
• 关键词: 遺伝子ベクター; 2本鎖RNA; RNAレプリコン; イネ; カルス; パーティクルガン; GFP; ハイグロマイシン; プラスミド

日本型イネには、宿主に明確な病徴を示さず、種子及び花粉による垂直伝播のみが認められるといったプラスミド様性質を示す2本鎖RNAレプリコンが存在する。本研究は、イネ2本鎖RNAのプラスミド的な諸性質を利用して、植物における全く新しいタイプの遺伝子ベクター開発を目的とする。遺伝子導入用コンストラクトは、イネ2本鎖RNAの両末端をRT-PCRで増幅しT7プロモーターを付加したDNA断片に、選抜マーカーとしてハイグロマイシン抵抗性遺伝子およびレポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を組み込んだものを作製した。このコンストラクトよりin vitroで転写したRNAを直接パーティクルガンで2本鎖RNAを保持するイネカルスに打ち込んだ。打ち込んだRNAは、複製酵素遺伝子を欠いているため、それ自身では複製できないが、2本鎖RNAを含むカルスに導入することにより、内在する2本鎖RNAがコードする複製酵素により複製し、ベクターとして機能することを期待している。RT-PCRで増幅する2本鎖RNAの両末端について400bp-1,500bpの範囲で種々の長さのコンストラクトを作成、2本鎖RNAを持つイネカルス(日本晴品種)に導入し、ハイグロマイシンを用いた選抜および緑色蛍光の観察等を行った結果、導入したハイグロマイシンおよびGFP遺伝子の発現が示唆された。これら遺伝子の発現を確認するため、導入したRNAの有無をノーザンハイブリダイゼーションにて解析したが、シグナルは検出できなかった。RT-PCRでは、GFP遺伝子RNAの存在が確認できたことから、導入したコンストラクトは一時的には複製するものの、その後の複製・維持に問題がある可能性が示唆された。より安定性の高いベクター開発を目標に実験を続けている。

Japanese type イ ネ に は, host に clear な 徴 を shown さ ず, seed and pollen に び よ る vertical 伝 sowing の み が recognize め ら れ る と い っ た プ ラ ス ミ ド others in nature を す 2 this lock in RNA レ プ リ コ ン が exist す る. は, this study イ ネ 2 this lock RNA の プ ラ ス ミ ド を な all properties using し て, plant に お け る く all new し い タ イ プ の posthumous son 伝 ベ ク タ ー open 発 を purpose と す る. Heritage 伝 son import with コ ン ス ト ラ ク ト は, イ ネ 2 this lock RNA の struck end を rt-pcr で rights of し T7 has プ ロ モ ー タ ー を plus し た DNA fragment に, sorting マ ー カ ー と し て ハ イ グ ロ マ イ シ ン resistance heritage 伝 son お よ び レ ポ ー タ ー heritage 伝 son と し て 蛍 green light タ ン パ ク mass (GFP) heritage 伝 son を group み 込 ん だ も の Youdaoplaceholder0 is made into た. こ の コ ン ス ト ラ ク ト よ り in vitro で planning write し た RNA を directly パ ー テ ィ ク ル ガ ン で 2 this lock RNA を keep す る イ ネ カ ル ス に play ち 込 ん だ. Play ち 込 ん は だ RNA replication and enzyme heritage 伝 を son owe い て い る た め, そ れ itself で は copy で き な い が, 2 the lock RNA を contains む カ ル ス に import す る こ と に よ り, inner す る 2 this lock RNA が コ ー ド す る replication enzyme に よ り copy し, ベ ク タ ー と し て function す る こ と を expect し て い る. Rt-pcr で rights of す る 2 this lock RNA の struck end に つ い て 400 bp to 1500 bp の van 囲 で kind 々 の long さ の コ ン ス ト ラ ク ト を done, 2 this lock RNA を つ イ ネ カ ル ス に import し fine varieties (Japan), ハ イ グ ロ マ イ シ ン を with い た choose sorting お よ び 蛍 green light の 観 examine such as line を っ た results, import し Youdaoplaceholder0 たハ グロ グロ された シ シ およびGFP will 伝 show が instigations された. こ れ ら posthumous son 伝 の 発 を now confirmed す る た め, import し た RNA の presence of を ノ ー ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に て parsing し た が, シ グ ナ ル は 検 out で き な か っ た. Rt-pcr で は, GFP but 伝 RNA の exist が confirm で き た こ と か ら, import し た コ ン ス ト ラ ク ト は transient に は copy す る も の の, そ の の after copying, maintain に problem が あ が る possibility in stopping さ れ た. Youdaoplaceholder0 <s:1> stability <s:1> high よ ベ タ タ を development を objective に experiment を続けて る る.

项目成果

福原敏行: "植物の細胞内に共生する2本鎖RNAレプリコン"化学と生物. 40・8. 500-502 (2002)

福原敏之：“植物细胞中共存的双链RNA复制子”化学与生物学40・8（2002）。

Koga R., Horiuchi H., Fukuhara T.: "Double-stranded RNA replicons associated with chloroplasts of a green alga, Bryopsis cinicola"Plant Molecular Biology. (印刷中). (2003)

Koga R.、Horiuchi H.、Fukuhara T.：“与绿藻 Bryopsis cinicola 叶绿体相关的双链 RNA 复制子”植物分子生物学（2003 年出版）。

Harada A., Fukuhara T., Takagi S.: "Plasma membrane H^+-ATPase under control of photosynthesis in Vallisneria leaves. II Presence of putative isogenes and a protein equipped with a C-terminal autoinhibitory domain"Planta. 214・6. 870-876 (2002)

Harada A.、Fukuhara T.、Takagi S.：“苦草叶中光合作用控制下的质膜 H^+-ATP 酶。II 假定同基因和配备 C 端自抑制结构域的蛋白质的存在”Planta。 .870-876 (2002)

Muramatsu Y., Harada A., Ohwaki Y., Kasahara Y., Takagi T., Fukuhara T.: "Salt-tolerant ATPase activity in the plasma membrane of the marine angiosperm Zostera marina L"Plant and Cell Physiology. 43・10. 1137-1145 (2002)

Muramatsu Y.、Harada A.、Ohwaki Y.、Kasahara Y.、Takagi T.、Fukuhara T.：“海洋被子植物 Zostera marina L 质膜中的耐盐 ATP 酶活性”植物和细胞生理学 43・10。 .1137-1145 (2002)

Horiuchi H., Moriyama H., Fukuhara T.: "Inheritance of Oryza sativa endornavirus in F1 and F2 hybrids between japonica and indica rice."Genes & Genetic Systems. 78. 299-234 (2003)

Horiuchi H.、Moriyama H.、Fukuhara T.：“粳稻和籼稻 F1 和 F2 杂交种中稻内核病毒的遗传。”基因