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植物の新規な遺伝子ベクターの開発

新型植物基因载体的开发

基本信息

批准号：
14656127
负责人：
福原敏行
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

日本型イネには、宿主に明確な病徴を示さず、種子及び花粉による垂直伝播のみが認められるといったプラスミド様性質を示す2本鎖RNAレプリコンが存在する。本研究は、イネ2本鎖RNAのプラスミド的な諸性質を利用して、植物における全く新しいタイプの遺伝子ベクター開発を目的とする。遺伝子導入用コンストラクトは、イネ2本鎖RNAの両末端をRT-PCRで増幅しT7プロモーターを付加したDNA断片に、選抜マーカーとしてハイグロマイシン抵抗性遺伝子およびレポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を組み込んだものを作製した。このコンストラクトよりin vitroで転写したRNAを直接パーティクルガンで2本鎖RNAを保持するイネカルスに打ち込んだ。打ち込んだRNAは、複製酵素遺伝子を欠いているため、それ自身では複製できないが、2本鎖RNAを含むカルスに導入することにより、内在する2本鎖RNAがコードする複製酵素により複製し、ベクターとして機能することを期待している。RT-PCRで増幅する2本鎖RNAの両末端について400bp-1,500bpの範囲で種々の長さのコンストラクトを作成、2本鎖RNAを持つイネカルス(日本晴品種)に導入し、ハイグロマイシンを用いた選抜および緑色蛍光の観察等を行った結果、導入したハイグロマイシンおよびGFP遺伝子の発現が示唆された。これら遺伝子の発現を確認するため、導入したRNAの有無をノーザンハイブリダイゼーションにて解析したが、シグナルは検出できなかった。RT-PCRでは、GFP遺伝子RNAの存在が確認できたことから、導入したコンストラクトは一時的には複製するものの、その後の複製・維持に問題がある可能性が示唆された。より安定性の高いベクター開発を目標に実験を続けている。

The Japanese type of virus has specific disease characteristics in the host, seed and pollen, and vertical propagation. This study aims to exploit the properties of RNA molecules and to develop novel RNA molecules in plants. PCR amplification of the RNA terminal of the gene 2 lock gene for gene introduction, selection of DNA fragments, selection of resistant gene fragments, selection of green fluorescent protein (GFP) gene fragments, and assembly of gene fragments. This is the first time in history that we've seen this. 2. The function of RNA replication enzyme is expected to be transferred to the target RNA by the replication enzyme gene. RT-PCR amplification of 2-locked-RNA terminal regions ranging from 400bp to 1,500 bp was carried out, and 2-locked-RNA gene expression was carried out (Nipponbare variety). The results of RT-PCR amplification of 2-locked-RNA terminal regions ranged from 400 bp to 1,500 bp. The expression of the gene is confirmed by the presence or absence of the gene. RT-PCR confirms the existence of GFP gene RNA, and the possibility of replication and maintenance after introduction is indicated. High stability and development goals