イネ2本鎖RNAにみられるニック生成機構の解析

水稻双链RNA切口产生机制分析

基本信息

批准号：
07854051
负责人：
福原敏行
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は種々の日本型イネ品種より約14kbpのプラスミド様性質を持つ2本鎖RNAを発見した。この2本鎖RNAの全塩基配列を決定し13,716kbの巨大なオープンリーディングフレームがコードされていること、2本鎖RNAのコーディング(+)鎖には、5'末端より1,211塩基の位置にニックが存在していること等を明らかにした。本研究では、ニックの生成機構を解析するために、ニックの部分を含むcDNAを鋳型に用いた試験管内RNA合成反応により、420塩基の人工2本鎖RNAを調整した。この2本鎖RNAに本来の位置で切断が起こると、150塩基と270塩基のRNAが生成する。その生成物をポリアクリルアミド電気泳動で検出する実験系を確立した。種々の実験条件を検討したが、特異的切断反応は検出できなかった。この結果は、人工2本鎖RNAがカバーする範囲よりもより広範囲のRNAの構造が切断反応に必要であることを示唆している。今後、より広範囲の配列を持つ人工RNAを用いた実験により、切断反応の詳細を解析したい。次に、2本鎖RNAの複製反応とニック生成反応の関係を解析するために、試験管内2本鎖RNA複製反応系を確立した。2本鎖RNAを含むイネ種子由来の培養細胞より、分画遠心により粗酵素液を調整し、反応生成物をアガロースゲル電気泳動により解析した。その結果、約14kbの生成物の他に、約1.2kbの生成物が検出された。この結果は、2本鎖RNAの複製反応において、全長(14kb)の2本鎖RNAが生成されると直ぐに、ニックが生成する事を示している。さらに、2本鎖RNAの複製反応において、RNA合成反応と、その切断反応(ニックの生成)が密接に関連していることや、ニックの生成が2本鎖RNAのコピー数制御に関わっている可能性を示唆している。

我们发现了双链RNA，具有大约14 kbp的质粒样特性，来自各种日本大米品种。该双链RNA的整个基本序列被确定，以揭示编码13,716 Kb的巨大开放式阅读框，并且双链RNA的编码（+）链位于5'端的1,211个位置。在这项研究中，为了分析刻痕的形成机理，使用包含划痕部分作为模板的cDNA，通过体外RNA合成反应来调整420个基本人造双链RNA。当这种双链RNA在其原始位置上裂解时，会产生150和270个RNA。建立了一个实验系统，其中通过聚丙烯酰胺电泳检测到产物。研究了各种实验条件，但是未检测到特定的切割反应。该结果表明，裂解反应所需的RNA结构范围要比人工双链RNA所覆盖的范围更大。将来，我们想通过使用具有更广泛序列的人工RNA来分析实验的切割反应的细节。接下来，为了分析双链RNA的复制反应与镍产生反应之间的关系，建立了视Nimin- vitamin双链RNA复制反应系统。粗酶溶液是由通过分裂离心衍生自包含双链RNA的水稻种子的培养细胞制备的，并通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物。结果，除了大约14kb的产品外，还检测到了约1.2kb的产品。该结果表明，在双链RNA的复制反应中，在产生全长（14 kb）双链RNA时会立即产生迹线。此外，在双链RNA的复制反应中，RNA合成反应及其裂解反应（刺激刻痕）密切相关，这表明尼克的产生可能与调节双链RNA的拷贝数有关。