日本型イネに常在する2本鎖RNAの複製機構の解析

約50の独立したcDNAクローンの塩基配列を決定することにより、日本型イネに常在する2本鎖RNAの全塩基配列(13,952塩基対)を決定した。この2本鎖RNAには、13,716塩基対(4,572アミノ酸残基)の巨大なオープンリーディングフレーム(ORF)が存在し、その5'側の上流域には166塩基対の非翻訳領域、3'側の下流域には70塩基対の非翻訳領域が存在したが、ポリA配列は存在しなかった。そのORFのN末端から約1,500アミノ酸残基の周辺にRNAヘリカーゼ様の配列、C末端にはRNA依存RNA合成酵素(RNA複製酵素)様のアミノ酸配列が見いだされた。このことは、この2本鎖RNAが宿主ゲノムとは独立に、RNA自身がコードするRNA複製酵素により複製するRNAレプリコンであることを示唆している。さらに5'非翻訳領域には複雑なステム・ループ構造が検出され、この領域が複製酵素の認識部位として機能していることが示唆された(投稿準備中)。上記の5'非翻訳領域が複製酵素の認識部位として機能しているかどうかを解析する為、それらの領域を含むcDNAを、植物の遺伝子導入用プラスミドpBI221の35SプロモーターとGUS遺伝子の間に導入したキメラプラスミドpBRD15、およびpLANHmの35Sプロモーターとハイグロマイシン抵抗性遺伝子の間に導入したキメラプラスミドpLRD11、さらにpLANHmのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を2本鎖RNAの5'末端と3'末端のcDNAではさみこむように設計したプラスミドpLRD111を構築した。2本鎖RNAを持つ日本晴品種の種子胚より確立した培養細胞に上記のキメラプラスミドをPEG法を用いて導入し、現在その組み換え体の解析を行っている。

約50の独立したcDNAクローンの塩基配列を決定することにより、日本型イネに常在する2本鎖RNAの全塩基配列(13,952塩基対)を決定した。この2本鎖RNAには、13,716塩基対(4,572アミノ酸残基)の巨大なオープンリーディングフレーム(ORF)が存在し、その5'側の上流域には166塩基対の非翻訳領域、3'側の下流域には70塩基対の非翻訳領域が存在したが、ポリA配列は存在しなかった。そのORFのN末端から約1,500アミノ酸残基の周辺にRNAヘリカーゼ様の配列、C末端にはRNA依存RNA合成酵素(RNA複製酵素)様のアミノ酸配列が見いだされた。このことは、この2本鎖RNAが宿主ゲノムとは独立に、RNA自身がコードするRNA複製酵素により複製するRNAレプリコンであることを示唆している。さらに5'非翻訳領域には複雑なステム・ループ構造が検出され、この領域が複製酵素の認識部位として機能していることが示唆された(投稿準備中)。上記の5'非翻訳領域が複製酵素の認識部位として機能しているかどうかを解析する為、それらの領域を含むcDNAを、植物の遺伝子導入用プラスミドpBI221の35SプロモーターとGUS遺伝子の間に導入したキメラプラスミドpBRD15、およびpLANHmの35Sプロモーターとハイグロマイシン抵抗性遺伝子の間に導入したキメラプラスミドpLRD11、さらにpLANHmのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を2本鎖RNAの5'末端と3'末端のcDNAではさみこむように設計したプラスミドpLRD111を構築した。2本鎖RNAを持つ日本晴品種の種子胚より確立した培養細胞に上記のキメラプラスミドをPEG法を用いて導入し、現在その組み換え体の解析を行っている。