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細菌由来のポリウレタン分解酵素の解析とその利用

细菌来源的聚氨酯降解酶的分析及其应用

基本信息

批准号：
09760069
负责人：
神戸敏明
金额：
$ 1.41万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760069/
关键词：
ポリウレタンエステラーゼ

项目摘要

エステル系PUR分解菌、Comamonas acidovorans TB-35株のPUR分解酵素について、以下の酵素学的および分子生物学的な検討を行なった。まず、既に精製されているTB-35株由来のPURエステラーゼを用いて、その酵素学的諸性質について検討を行った。その結果、本酵素は基質であるPURに疎水的に付着する部位を有し、その付着がPUR分解に関与していることが示唆された。次に、PUR分解酵素遺伝子をE.coliを宿主としてクローニングし、その全塩基配列を決定した。本遺伝子は1,644bpのORFからなり、550残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。本酵素の一次配列は、真核生物(Torpedo califormica)由来のアセチルコリンエステラーゼ(TAChE)と約30%の相同性を示したが、二次構造モチーフの比較より両酵素の立体構造が非常に類似していることが推察された。TAChEはSer,Glu,Hisを活性中心とするエステラーゼであるが、活性中心付近の一次配列の比較より、PURエステラーゼの活性中心もSer-Glu-His型であり、他の原核生物エステラーゼ(Ser-Asp-His型)とは異なる新規のエステラーゼであると考えられた。既に決定されているTAChEの立体構造をモデルとして、PURエステラーゼの立体構造を予測したところ、酵素表面に基質付着部位と思われる3つの疎水領域が存在した。この疎水領域が、酵素分子をPUR表面に付着させる役割を担っていると考えられ、その分解機構モデルは酵素学的検討により推察したモデルと一致した。さらに、大腸菌を宿主とした組み換え型PURエステラーゼの大量発現系を構築した。改変タンパクの効率的な精製方法として、ヒスチジンタグの付与を行い、これを用いてPURエステラーゼのタンパク質工学的改変を試みた。

PUR decomposing bacteria, Comamonas acidovorans TB-35 strain, the following enzymatic and molecular biological studies The origin of TB-35 strain was studied in detail. As a result, the enzyme has been shown to be involved in PUR decomposition in the presence of PUR. Second, PUR catabolic enzyme gene E.coli host is determined by the sequence of all genes. This gene contains 1,644 bp ORF, 550 residues and 1,644 amino acid residues. The primary alignment of this enzyme is similar to that of eukaryotic origin (TAChE), and the secondary structure of this enzyme is similar to that of eukaryotic origin (TAChE). TAChE is Ser,Glu,His active center, PUR active center, Ser-Glu-His active center, Ser-Asp-His active center, and other prokaryotes. Therefore, the three-dimensional structure of TAChE is determined, and the three-dimensional structure of PUR is predicted, and the substrate attached to the enzyme surface is determined. This is the first time that the enzyme molecule has been detected in the PUR surface. A large number of development systems were constructed for E. coli. The refining method of improving the quality of the product is to try to improve the quality of the product.